【摘要】：西藏蕪菁(Brassica rapa L.)是在高寒低氧的惡劣環(huán)境下孕育出來的藥、食、飼三用植物。傳統(tǒng)的藏醫(yī)學典著和現(xiàn)代的《四川省藏藥材標準》等對西藏蕪菁有著詳細的性狀描述和功效記載,表明其具有"清熱解毒"、"滋補增氧"、"治療身體虛弱"、"祛風"等功效。同時,本課題組前期的研究及文獻報道均表明西藏蕪菁塊莖的醇提物、水提物和全粉等均具有良好的抗缺氧功效。然而,對于西藏蕪菁的抗缺氧有效成分及其作用機制方面的研究尚未見報道。因此,本文首先采用人體試食試驗對西藏蕪菁微粉的抗缺氧功效進行驗證。接著,以dPC12細胞在缺氧條件下的低細胞活力為依據(jù),建立物理缺氧和化學缺氧模型,通過體外評價明確西藏蕪菁中具有缺氧神經(jīng)損傷防護功效的部位,并對該部位進行有效成分的分離、制備、純化和結構解析。最后,分別從細胞水平和整體動物水平對有效化合物的抗缺氧功效及其作用機制進行研究。主要研究內(nèi)容及成果如下:1.采用為期7天的人體試食試驗,結合低氧耐受測試(hypoxia inhalation test,HIT)(模擬7500 m海拔高度,氧含量7.1%)、運動心肺功能測試(Bruce方案)和血生化指標檢測,考察了連續(xù)攝取西藏蕪菁微粉(7.5 g× 2次/天)對普通健康人群低氧耐受力的影響。結果顯示,西藏蕪菁微粉能有效提高機體在HIT中的SpO2,緩解缺氧的不良癥狀,對機體的抗氧化能力具有顯著改善作用(P0.05)。運動心肺功能測試表明蕪菁微粉可以顯著延后受試者的無氧閾出現(xiàn)時間、提高男性受試者的最大氧脈搏和女性受試者的最大公斤體重攝氧量(P0.05)。此外,蕪菁微粉還能顯著增加男性受試者血液中的平均血紅蛋白濃度(P0.05)。進一步印證了西藏蕪菁提高健康人群低氧耐受的功效。2.采用類神經(jīng)dPC12細胞(differentiated PC12 cell)株,分別建立物理缺氧和化學缺氧兩種體外評價模型。物理缺氧的造模條件:培養(yǎng)箱氣體組成比例為:0.5%O2+5%CO2 + 94.5%N2,培養(yǎng)時間36h;化學缺氧的造模條件:CoCl2濃度為300μmol/L,培養(yǎng)時間36h。西藏蕪菁干粉用無水乙醇熱回流提取,然后采用有機溶劑進行分級萃取、獲得不同極性的部位。體外活性評價表明,正丁醇-乙酸乙酯相(中等極性部位)對缺氧導致的dPC12細胞損傷具有較好的防護作用,認定其為蕪菁抗缺氧的有效活性部位。3.采用硅膠柱層析、固相萃取、制備型液相色譜等技術手段對上述有效部位進行分離、純化和制備,從中得到10個單體化合物;并采用LC/Q-TOF/MS、NMR和X-單晶衍射等手段鑒定出6個酚酸類化合物,分別為4-羥基-苯甲酸葡萄糖苷、反式-對香豆酸葡萄糖苷、順式-對香豆酸葡萄糖苷、反式-阿魏酸葡萄糖苷、阿魏酸和芥子酸。運用dPC12細胞體外評價模型,篩選出其中抗缺氧活性優(yōu)良的化合物為:反式/順式-對香豆酸葡萄糖苷(cis/trams-p-coumaric acid-β-D-glucopyranoside),且以反式結構為主要存在形式。4.研究反式-對香豆酸葡萄糖苷(CG)對物理缺氧(0.5%O2)條件下細胞損傷的防護作用及其機制。用濃度為5～50μmol/L的CG處理dPC12細胞能夠有效增加細胞活力、降低細胞中LDH的釋放、減少細胞凋亡,并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關系。同時,50μmol/L的CG能顯著抑制缺氧導致的dPC12細胞線粒體膜電位的下降和細胞色素C的釋放,提升細胞中抗凋亡蛋白(Bcl-2/Bax和Bcl-XL)的表達,降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Caspase-9)的活力(P0.05)。此外,qRT-PCR分析結果表明,CG同時也影響了編碼上述蛋白的mRNA水平。5.根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中的抗缺氧評判標準,采用ICR小鼠常壓耐缺氧試驗進一步驗證西藏蕪菁的有效部位。連續(xù)30天灌胃50 mg/kg.bw/d的西藏蕪菁正丁醇相,能夠顯著延長雄性小鼠的缺氧存活時間(P0.05),顯示出較好的抗缺氧功效。接著,采用急性缺氧動物模型,研究了正丁醇相及其特征性化合物(CG)的苷元----香豆酸(CA)的抗缺氧相關機制,試驗周期為7天,灌胃給藥。急性缺氧條件為:15 min內(nèi)將低氧氧艙中氧含量從21%降至9.5%,保持6 h。結果顯示,急性缺氧模型顯著增加了小鼠肺的含水量(P0.01),而正丁醇相(50 mg/kg.bw/d)和不同劑量的 CA(25、100 mg/kg.bw/d)均能有效抑制肺含水量的升高(P0.05);生化分析表明,其機制可能與提高急性缺氧條件下肺組織中Na+,K+-ATP酶活力、增強抗氧化能力(SOD↑、CAT↑和MDA↓)、抑制炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的升高有關。此外,50 mg/1kg.bw/d的正丁醇相對急性缺氧導致的小鼠腦組織中ATP的下降有一定的阻滯作用,可能與提高大腦無氧酵解相關酶(PK、PFK和LDH)的活力有關。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS218

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本文編號：2383333