【摘要】：α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類通過延緩腸道內(nèi)糖類物質(zhì)的消化吸收而達到治療糖尿病的口服降糖藥物。阿卡波糖(acarbose)是由放線菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)與寡糖類似的化合物,這種化合物對寡糖酶的活性具有抑制作用。這類降糖藥能抑制人體消化道對糖類的吸收,能夠用于II型糖尿病的治療。本論文研究產(chǎn)阿卡波糖放線菌的選育、誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化以及代謝調(diào)控。從土壤中篩選產(chǎn)阿卡波糖的放線菌,采用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對該菌進行誘變育種,采用推理育種的篩選方法,獲得了阿卡波糖的高產(chǎn)菌株,采用兩階段發(fā)酵法,大幅度地提高了阿卡波糖的產(chǎn)量。采用海藻酸鈉凝膠添加粉末活性炭,研究固定化對放線菌發(fā)酵產(chǎn)阿卡波糖的影響。最后研究了糖酵解抑制劑氟化鈉和碘乙酸對放線菌發(fā)酵產(chǎn)阿卡波糖的代謝調(diào)控作用。本文的主要研究內(nèi)容如下:1、在分離放線菌的過程中,將土壤樣品室溫風(fēng)干5天,然后將土壤稀釋液于60°C進行加熱處理20 min,在高氏一號固體培養(yǎng)基中添加100 mg/L的K2Cr2O7,抑制細菌、酵母菌、霉菌的生長繁殖,提高了放線菌的篩選效率,有利于放線菌的分離。2、建立了發(fā)酵液中阿卡波糖含量快速測定的薄層色譜法。采用Merck薄層層析硅膠板,以正丙醇:水=8:2(v/v)為展層劑,以含10%(v/v)的磷酸、2%(v/v)的苯胺,2%(w/v)的二苯胺的丙酮溶液作為顯色劑。層析板上的阿卡波糖通過噴顯色劑后,于110°C烘干10 min,阿卡波糖的最大吸收波長為540 nm,在2.0-10.0μg范圍內(nèi),峰面積y對阿卡波糖含量x(μg)線性回歸分析得到方程:y=108.27 x+432.61(r2=0.9997)。該測定方法具有操作簡單、快速的優(yōu)點,可以用于快速分析大批量的樣品,為菌種的高通量篩選提供了快速分析方法。篩選到一株放線菌JN537,其阿卡波糖產(chǎn)量達1830 mg/L。3、采用ARTP誘變系統(tǒng)對放線菌JN537進行誘變育種,誘變條件為:處理距離2mm、誘變時間2 min、處理溫度30-40°C、氣體流速2.5 L/min、致死率為90.4%。用推理育種方法,選育對青霉素抗性敏感突變菌株,其細胞壁合成能力較弱,合成細胞壁的前體物質(zhì)(多糖、氨基酸)轉(zhuǎn)向合成阿卡波糖,達到選育阿卡波糖高產(chǎn)菌株的目的。從青霉素抗性敏感突變菌株中篩選到一株阿卡波糖高產(chǎn)菌株StreptomycesM37,其阿卡波糖的產(chǎn)量達2974 mg/L,比出發(fā)菌株提高了62.5%。通過薄層色譜法測定細胞壁單糖的組成和含量,與出發(fā)菌株相比,該突變菌株StreptomycesM37的細胞壁的葡萄糖和核糖的含量分別減少了23.1%和31.6%。通過高效液相色譜法測定細胞壁的氨基酸含量,突變菌株的細胞壁二氨基庚二酸和甘氨酸的含量減少了16.4%和27.2%。研究表明:通過10次傳代,該突變菌株的阿卡波糖產(chǎn)量比較穩(wěn)定。4、研究了pH值對細胞生長和代謝產(chǎn)物積累的影響。實驗結(jié)果表明,pH 7.0有利于放線菌菌體細胞的生長,但不利于阿卡波糖的合成;pH 8.0有利于阿卡波糖的合成,但不利于菌體細胞生長。pH值8.0時,分批發(fā)酵的阿卡波糖產(chǎn)量最高,達3345 mg/L。在放線菌發(fā)酵的第72 h,添加0.1 mol/L NH4Cl有利于阿卡波糖的合成;向培養(yǎng)基中添加葡萄糖和麥芽糖的質(zhì)量比為1:2(還原糖的總添加量為20 g/L),有利于Streptomyces M37合成阿卡波糖。由此提出了兩階段培養(yǎng)模式:在發(fā)酵的前72 h控制pH值為7.0,促進菌體細胞的生長;在發(fā)酵后期控制pH值為8.0,在發(fā)酵后期添加阿卡波糖合成的前體物質(zhì)(NH4Cl、葡萄糖和麥芽糖),通過兩階段發(fā)酵,阿卡波糖的產(chǎn)量達6210mg/L提高了85.7%。采用兩階段培養(yǎng)模式,G6PDH和GDH活性的增加,有助于阿卡波糖的合成。5、在2%的海藻酸鈉凝膠中添加1.5%的粉末活性炭有助于放線菌StreptomycesM37的固定,掃描電鏡觀察表明添加粉末活性炭后的膠珠具有多孔性。粉末活性炭表面粗燥、具有親水性,有助于放線菌Streptomyces M37的固定化和物質(zhì)傳遞。與游離細胞發(fā)酵相比,阿卡波糖的產(chǎn)量提高了23.9%達5465 mg/L,發(fā)酵過程中細胞的滲漏量降低了61.3%,發(fā)酵時間縮短為96 h。6、研究糖酵解抑制劑氟化鈉和碘乙酸對放線菌發(fā)酵產(chǎn)阿卡波糖的影響。在放線菌發(fā)酵的第72 h,添加2 mg/L的碘乙酸,阿卡波糖的濃度提高了12.1%。在放線菌發(fā)酵的第96 h,添加15 mg/L的氟化鈉,阿卡波糖的濃度提高了14.6%。在放線菌發(fā)酵的第72 h添加1.5 mg/L的碘乙酸、在放線菌發(fā)酵的第96 h添加10 mg/L的氟化鈉,阿卡波糖的產(chǎn)量達到5358 mg/L,比對照組提高了21.5%。添加碘乙酸和氟化鈉后,3-磷酸甘油醛脫氫酶和烯醇化酶的比活力分別下降了19.6%和21.0%;與此同時,6-磷酸葡萄糖脫氫酶的比活力平均升高了34.5%,使碳源更多地流向HMP途徑,為阿卡波糖的生物合成提供更多的前體物質(zhì)。研究表明碘乙酸和氟化鈉對放線菌合成阿卡波糖的代謝調(diào)控有協(xié)同促進作用。
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【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ920.1;TQ464

【參考文獻】

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本文編號：2381500