本文選題：熒光探針 + 順磁探針　； 參考：《中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所)》2017年博士論文

【摘要】：蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔者,廣泛的參與機體的各項生理過程。蛋白質(zhì)的動態(tài)學特征對其行使相應的功能具有非常關鍵的作用,獲得蛋白質(zhì)高分辨率的結(jié)構(gòu)和動態(tài)信息對于理解其運行機制具有重要的指導意義。目前用于蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)研究的實驗手段主要包括核磁共振,熒光光譜等技術。熒光光譜用于研究蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)最常用的方法是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),利用熒光基團之間能量傳遞的效率與距離的關系,可以得到標記位點之間的距離約束,用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計算。因為除了熒光蛋白以外,一般蛋白質(zhì)并沒有好的熒光性能,因此進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移的一個前提是需要對蛋白質(zhì)進行熒光標記。在活細胞水平上對蛋白質(zhì)進行熒光標記最常用的手段是將熒光蛋白融合表達在目的蛋白的末端,然而熒光蛋白嵌入蛋白后,往往會對目標的蛋白的可溶性造成影響,或者熒光蛋白本身難以正確折疊。另外一個問題是熒光蛋白本身成熟發(fā)光需要一定的時間,往往以小時計,因此發(fā)展對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響小的快速熒光標記方法非常必要。順磁核磁包括順磁弛豫增強(PRE)和贗接觸化學位移(PCS)等,其基本原理是利用未成對電子與原子核之間偶極偶極相互作用從而得到長程的幾何約束。進行順磁核磁的前提需要對蛋白質(zhì)進行順磁標記,標記的剛性直接決定了所計算結(jié)構(gòu)的精細程度,因此發(fā)展能夠特異性定點標記的剛性順磁探針顯得尤為重要�；谝陨系目茖W問題,在熒光標記探針的發(fā)展方面,本論文設計了一種基于split-GFP的全新的細胞表面膜蛋白的熒光標記方式。從結(jié)構(gòu)出發(fā),將超折疊綠色熒光蛋白sfGFP拆分為兩部分,將其桶狀結(jié)構(gòu)中的第10和第11條β-strand(GFP10-11)融合表達于目標蛋白的胞外區(qū)域,另一方面,通過全長sfGFP酶切制備得到由第1到9條β-strand組成并包含成熟生色團的GFP1-9"帽子",通過GFP10-11和GFP1-9的結(jié)合實現(xiàn)熒光從off到on的過程,從而實現(xiàn)活細胞水平上細胞表面膜蛋白熒光的標記。通過這一全新的熒光標記手段,我們研究了 G蛋白偶聯(lián)受體GPR17和半胱氨酰白三烯受體CysLT2R的內(nèi)化行為,發(fā)現(xiàn)這兩種G蛋白偶聯(lián)受體都會發(fā)生內(nèi)化,從細胞膜進入到細胞質(zhì)中。在順磁標記探針的發(fā)展方面,基于小分子螯合劑DTPA骨架,本論文設計了DTTA-C3和DTTA-C4兩種通過點擊反應連接的剛性順磁探針,該兩種探針具有非常好的對稱性,我們通過調(diào)節(jié)連接基團和鑭系金屬螯合基團之間碳原子的個數(shù)對探針的剛性進行了優(yōu)化。通過密碼子擴展的方式在蛋白質(zhì)的特定位點引入帶有疊氮基團的非天然氨基酸后,結(jié)合點擊化學反應,在蛋白質(zhì)的特定位點引入順磁標記,這種順磁標記的方式可以解決傳統(tǒng)的通過半胱氨酸連接的探針要求蛋白質(zhì)表面有且僅有一個半胱氨酸的問題,從而可用于含多個半胱氨酸的蛋白質(zhì)體系的研究。我們對新發(fā)展順磁探針的性質(zhì)進行了表征,相比于目前已經(jīng)報道的同類型探針,DTTA-C3探針具有最好的剛性。運用該探針產(chǎn)生的PCS約束,我們成功解析了瞬態(tài)相互作用復合體UBA1-Ub的結(jié)構(gòu)。進一步,本論文結(jié)合單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移和順磁核磁共振等多種生物物理方法,對RSV(Rous Sarcoma Virus)衣殼蛋白在溶液中的動態(tài)結(jié)構(gòu)進行了研究。通過單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)提供的距離分布信息從而得到多態(tài)的比例信息,結(jié)合順磁核磁提供的幾何約束信息,我們擬計算RSV衣殼蛋白在溶液中兩態(tài)的系綜結(jié)構(gòu)。在此基礎上,我們試圖闡明多態(tài)分布的結(jié)構(gòu)基礎和多態(tài)結(jié)構(gòu)與衣殼蛋白組裝的關系,并最終弄清逆轉(zhuǎn)錄病毒組裝機制。綜上所述,本論文圍繞蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)和功能研究的探針開發(fā)方面發(fā)展了一種用于活細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體的熒光標記方法,并通過該方法確定了兩種G蛋白偶聯(lián)受體GPR17和CysLT2R的內(nèi)化行為;其次,發(fā)展了兩種通過點擊化學反應連接的剛性順磁探針,并通過該順磁探針的標記結(jié)合順磁核磁的實驗方法解析了瞬態(tài)復合物UBA1-Ub的復合體結(jié)構(gòu),獲得了精細的動態(tài)結(jié)構(gòu)信息。圍繞蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的研究方面,論文結(jié)合單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術和順磁核磁共振的方法,試圖解析RSV衣殼蛋白在溶液中的多態(tài)結(jié)構(gòu),并嘗試闡明逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白的組裝機制。
[Abstract]:This paper designs a new fluorescence labeling method based on split - GFP . In this paper , we have studied the structure of protein - coupled receptors , such as DTTA - C3 and DTTA - C4 , by means of single - molecule fluorescence resonance energy transfer and paramagnetic resonance .
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3;O629.73

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本文編號：2064391