本文選題：釀酒酵母 + 類胡蘿卜素　； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：釀酒酵母是異源合成天然產(chǎn)物的重要宿主,但是在釀酒酵母中構(gòu)建遺傳穩(wěn)定性好、基因表達(dá)可控的代謝途徑仍然是代謝工程和合成生物學(xué)中的一大挑戰(zhàn)。類胡蘿卜素是具有抗氧化、防癌等功效的高附加值四萜類化合物。本文以開(kāi)發(fā)代謝途徑組裝工具和策略為基礎(chǔ),結(jié)合代謝途徑基因的表達(dá)調(diào)控,關(guān)鍵酶的定向進(jìn)化等技術(shù),對(duì)在釀酒酵母中構(gòu)建高效的β-胡蘿卜素和番茄紅素生物合成途徑進(jìn)行了研究。首先,從紅法夫酵母cDNA中克隆了CrtE, CrtYB和CrtI三個(gè)基因,并將其按照傳統(tǒng)的代謝途徑方法在高拷貝的2μ附著型載體上進(jìn)行了表達(dá),獲得了能合成p-胡蘿卜素的重組菌株。由于該方法構(gòu)建的菌株遺傳不穩(wěn)定,我們探索了其它策略,以實(shí)現(xiàn)代謝途徑在基因組中的組裝。為了能將長(zhǎng)的代謝途徑有效地整合進(jìn)釀酒酵母的基因組中,研究中構(gòu)建了一套基于Cre/loxP重組系統(tǒng)的pMRI載體。經(jīng)過(guò)測(cè)試,該套載體在循環(huán)使用時(shí)其選擇標(biāo)記區(qū)段loxP-KanMX-pBR322ori-loxP的pop-out效率達(dá)到70%,可以有效地用于代謝途徑中相關(guān)基因的分步整合�；谒鶚�(gòu)建的載體工具,我們提出了代謝途徑的分散式整合策略(Decentralized assembly)。同時(shí)為了使所構(gòu)建的代謝途徑中的基因表達(dá)可以受到外部條件控制,對(duì)釀酒酵母的GAL調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行了改造,敲除了其中的GAL80基因,使GAL啟動(dòng)子所控制的基因表達(dá)可以受到外界葡萄糖濃度的調(diào)控。將兩個(gè)拷貝的CrtYB和CrtI以及一個(gè)拷貝的CrtE和tHMGl,共6個(gè)ORF整合到酵母基因組中,并利用改造后的GAL調(diào)控系統(tǒng)對(duì)上述基因的表達(dá)進(jìn)行控制,所得到的重組釀酒酵母菌株在搖瓶中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了11 mg/g DCW (72.57mg/L)o通過(guò)20代的連續(xù)培養(yǎng),證實(shí)了所構(gòu)建代謝途徑的遺傳穩(wěn)定性。代謝前體物質(zhì)的平衡利用是提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。通過(guò)建立以類胡蘿卜素顏色為指示的啟動(dòng)子強(qiáng)度表征系統(tǒng),對(duì)一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行了篩選,其中強(qiáng)啟動(dòng)子被用于基因的過(guò)表達(dá),而弱啟動(dòng)子則用于旁側(cè)代謝途徑的下調(diào)。結(jié)合組成型和誘導(dǎo)型β-胡蘿卜素合成途徑以及HXT1啟動(dòng)子控制的角鯊烯合成途徑,對(duì)節(jié)點(diǎn)物質(zhì)FPP的上游、下游和旁側(cè)基因的表達(dá)進(jìn)行了順序控制。通過(guò)上述策略構(gòu)建出了總類胡蘿卜素產(chǎn)量高達(dá)20.79 mg/g DCW (1156 mg/L)的釀酒酵母菌株。該菌株與實(shí)驗(yàn)中最初構(gòu)建的僅僅整合了CrtYB和CrtI基因的菌株相比,其單位細(xì)胞干重中總類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了約700倍。同時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了在發(fā)酵過(guò)程中代謝途徑中各基因的表達(dá)是以預(yù)期的順序進(jìn)行。此外,為了構(gòu)建能高效合成番茄紅素的菌株,研究中采用定向進(jìn)化的方法對(duì)合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行了逐個(gè)改造。其中,通過(guò)對(duì)CrtYB基因編碼的雙功能酶的環(huán)化酶功能區(qū)域進(jìn)行定向進(jìn)化,得到了環(huán)化酶失活,但八氫番茄紅素合酶功能域保留完好的突變體CrtYB11M;對(duì)CrtE基因定向進(jìn)化得到了表達(dá)量提高的正突變CrtE03M。與野生型相比,突變體CrtE03M在基因組上的表達(dá)使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了1.16倍。然后,通過(guò)調(diào)節(jié)不同Crt基因的拷貝數(shù),考察對(duì)菌株生物量和番茄紅素積累產(chǎn)生的影響,最后構(gòu)建出了YXWPD-14菌株。該菌株在無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵120 h后,單位發(fā)酵體積的總類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了1.6g/L,細(xì)胞內(nèi)的類胡蘿卜素干重含量為24.4mg/g DCW, HPLC分析表明其中90%的類胡蘿卜素為番茄紅素。
[Abstract]:Saccharomyces cerevisiae is an important host for the synthesis of natural products . However , it is a great challenge to construct high - efficiency 尾 - carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae . In order to make the gene expression in the metabolic pathway to be controlled by external conditions , the GAL control system of Saccharomyces cerevisiae was modified , and the expression of total carotenoid in the yeast genome was controlled by using the modified GAL control system .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 宋新娜;汪之頊;;美國(guó)的食物類胡蘿卜素含量數(shù)據(jù)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè));2007年03期

2 張學(xué)禮;;代謝工程發(fā)展20年[J];生物工程學(xué)報(bào);2009年09期

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本文編號(hào)：1850478