本文選題：亮氨酸應(yīng)答調(diào)控因子(Lrp家族) + 糖多孢紅霉菌　； 參考：《安徽大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：Lrp(Leucine-responsive regulatory protein)家族,又被稱(chēng)為 Lrp/AsnC 家族,是一類(lèi)廣泛存在于原核生物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能夠參與調(diào)控細(xì)胞的多個(gè)生理過(guò)程,包括氨基酸的代謝、胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA的修飾與重組、細(xì)菌抗性等多個(gè)方面。然而目前在產(chǎn)抗生素的放線(xiàn)菌中關(guān)于Lrp蛋白調(diào)控抗生素生物合成的研究非常少,具體的調(diào)控機(jī)制更是有待深入的探究。紅霉素(Erythromycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,由放線(xiàn)菌(Actinomycete)中糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)次生代謝產(chǎn)生,對(duì)于多種致病菌都具有較強(qiáng)大的抗菌活性。根據(jù)生物信息學(xué)分析,糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp(SACE_5388)基因編碼一種Lrp家族的同源蛋白,與已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中Lrp同源性高達(dá)56%,并且它們轉(zhuǎn)錄方向相反的鄰近基因都是編碼分支氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究首先利用大腸桿菌體外表達(dá)技術(shù)得到可溶性的SACE_Lrp蛋白,通過(guò)蛋白與DNA結(jié)合的EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 SACE_Lrp對(duì)鄰近的4CE_5387-5386具有直接的調(diào)控作用。為了探究SACE_Lrp在糖多孢紅霉菌中的功能,我們通過(guò)大片段敲除技術(shù)在糖多孢紅霉菌A226中構(gòu)建了SACE_Lrp缺失突變株。高效液相色譜分析表明,與出發(fā)菌株A226相比,SACE_Lrp缺失突變株(△SACE_Lrp)中紅霉素產(chǎn)量提高了 25%,而SACE_Lrp基因回補(bǔ)后,紅霉素的產(chǎn)量回復(fù)到出發(fā)菌株的水平,同時(shí)在A226中對(duì)SACE_Lrp過(guò)表達(dá)后紅霉素產(chǎn)量相比出發(fā)菌株下降23%,說(shuō)明SACE_Lrp對(duì)紅霉素生物合成具有負(fù)調(diào)控作用。SACE_Lrp的缺失對(duì)糖多孢紅霉菌的菌體生長(zhǎng)和形態(tài)分化并無(wú)明顯的影響。進(jìn)一步的qRT-PCR分析顯示,SACE_Lrp缺失突變株中紅霉素生物合成基因簇中基因eryAI和ermE、鄰近的分支氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SACE_5387-5386以及分支氨基酸代謝路徑中氨基轉(zhuǎn)移酶基因ilvE的轉(zhuǎn)錄水平都有顯著升高,表明SACE_Lrp很可能通過(guò)調(diào)節(jié)紅霉素結(jié)構(gòu)基因、鄰近分支氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因以及分支氨基酸代謝基因轉(zhuǎn)錄水平最終影響紅霉素的產(chǎn)生。利用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)A226與△SACE_Lrp的胞內(nèi)外游離氨基酸分析結(jié)果表明,△SACE_Lrp中胞外三種分支氨基酸(Val、Ile和Leu)的含量低于A226,而△SACE_Lrp胞內(nèi)三種分支氨基酸的含量也低于A226,說(shuō)明SACE_Lrp的缺失不僅影響分支氨基酸從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi),還影響了胞內(nèi)分支氨基酸的代謝轉(zhuǎn)化,從而影響紅霉素生物合成的前體供應(yīng)。我們?cè)谔嵌噫呒t霉菌A226中過(guò)量表達(dá)SACE5387-5386,紅霉素產(chǎn)量提高了 31%。進(jìn)一步在糖多孢紅霉菌A226的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加分支氨基酸后,紅霉素的產(chǎn)量相應(yīng)提高 47%(Val)、35%(Ile)和 16%(Leu)。本研究利用DNase I footprinting技術(shù)解析了糖多孢紅霉菌中SACE_Lrp的保守結(jié)合位點(diǎn)為一段富含GC的DNA序列:CCTCCGGGCAACATTC,并通過(guò)缺失突變進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)保守結(jié)合位點(diǎn)的分布位置,推測(cè)SACE_Lrp不僅調(diào)控鄰近的轉(zhuǎn)錄方向相反的S4CE_5387-5386,還可能具有自我調(diào)控的作用,本研究通過(guò)設(shè)計(jì)體內(nèi)的GFP報(bào)告系統(tǒng)證實(shí),SACE_Lrp對(duì)自身的轉(zhuǎn)錄存在轉(zhuǎn)錄抑制。Lrp家族的一大特征是C末端結(jié)構(gòu)域具有響應(yīng)配體氨基酸的能力,通過(guò)在體外EMSA體系中添加20種蛋白質(zhì)氨基酸,發(fā)現(xiàn)添加Lys和Arg可以抑制SACE_Lrp與靶DNA的結(jié)合,而添加His可以促進(jìn)蛋白與靶DNA的結(jié)合,說(shuō)明SACE_Lrp具有雙向響應(yīng)的氨基酸配體,Lys和Arg是抑制型配體,His是促進(jìn)型配體。進(jìn)一步通過(guò)設(shè)計(jì)體內(nèi)GFP報(bào)告系統(tǒng),證實(shí)了 SACE_Lrp在體內(nèi)情況下同樣可以對(duì)三種配體氨基酸進(jìn)行應(yīng)答。目前為止,糖多孢紅霉菌SACE_Lrp是Lrp家族蛋白中首次被解析雙向響應(yīng)配體的成員。糖多孢紅霉菌低產(chǎn)菌株A226中,SACE_Lrp的缺失、增加SACE_Lrp靶基因SACE_5387-5386的拷貝數(shù),以及添加SACE_Lrp調(diào)控底物分支氨基酸三種策略在提高紅霉素產(chǎn)量方面都取得了良好的效果。我們將這三種策略應(yīng)用于紅霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株WB。高效液相色譜分析表明,WB中缺失SACE_Lrp基因(WB△SACE_Lrp)后,突變株紅霉素產(chǎn)量提高19%;在缺失SACE_Lrp基因的基礎(chǔ)上過(guò)量表達(dá)SACE_5387-5386(WB△SACE_Lrp/5387-5386),紅霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株WB提高41%;在工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)中額外添加10 mM Val,WB△SACE_Lrp/5387-5386的紅霉素產(chǎn)量較WB提高48%,最終在5-L發(fā)酵罐水平上,紅霉素的產(chǎn)量由3503 mg/L顯著提高41%,達(dá)到5001mg/L。說(shuō)明在紅霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株中,以SACE_Lrp調(diào)控元件為基礎(chǔ)的改造確實(shí)可以顯著的提高紅霉素的產(chǎn)量,這一調(diào)控元件的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用為未來(lái)其他工業(yè)高產(chǎn)菌株的改造和篩選提供了基礎(chǔ)。根據(jù)同源性分析比對(duì),SACE_Lrp的同源蛋白廣泛存在于其他產(chǎn)抗生素的放線(xiàn)菌中,為了研究Lrp蛋白對(duì)于抗生素生物合成的調(diào)控功能是否具有普適性,我們選擇模式鏈霉菌-天藍(lán)色鏈霉菌作為代表。通過(guò)在天藍(lán)色鏈霉菌M145中缺失SACE_Lrp同源蛋白基因SCO3361,構(gòu)建缺失突變株△SCO3361,并對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),SCO3361缺失突變后,放線(xiàn)紫紅素(Act)的產(chǎn)量急劇下降至出發(fā)菌株的20%水平,而十一烷基靈菌紅素(Red)和鈣依賴(lài)抗生素(CDA)的產(chǎn)量并無(wú)顯著變化。SCO3361缺失突變后,菌株的產(chǎn)孢能力也明顯下降,說(shuō)明SC03361不僅調(diào)控天藍(lán)色鏈霉菌的次級(jí)代謝,還調(diào)控菌株的形態(tài)分化。這些結(jié)果說(shuō)明在產(chǎn)抗生素的放線(xiàn)菌中,Lrp同源蛋白對(duì)于抗生物生物合成的調(diào)控作用是很可能普遍存在的。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,SC03361缺失突變株中Act生物合成基因簇的簇內(nèi)調(diào)控蛋白基因actⅡ-ORF4(SC05085)和產(chǎn)孢相關(guān)蛋白基因amfC(SCO4184)、whiB(SCO3034)、ssgB(SCO1514)的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降,說(shuō)明SC03361對(duì)Act的生物合成和菌株的孢子形成具有顯著的正調(diào)控作用;△SC03361突變株中,自身基因表達(dá)量顯著升高,證實(shí)SC03361同樣具有抑制自身轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí),SC03361能夠結(jié)合actⅡ-ORF4的啟動(dòng)子,說(shuō)明SC03361能夠直接調(diào)控Act的生物合成基因簇。通過(guò)qRT-PCR分析結(jié)合EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SC03361也同樣可以直接調(diào)控鄰近的轉(zhuǎn)錄方向相反的SC03362。利用體外EMSA和體內(nèi)GFP報(bào)告系統(tǒng),解析Phe是SC03361的抑制型配體,Cys是SC03361的促進(jìn)型配體。EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)SACE_Lrp能夠與SC03361的靶DNA結(jié)合,而SC03361也能夠與SACE_Lrp的靶DNA結(jié)合,二者存在交叉調(diào)控的作用。我們的研究結(jié)果說(shuō)明天藍(lán)色鏈霉菌中Lrp同源蛋白SC03361不僅可以調(diào)控特定抗生素的生物合成,還調(diào)控了天藍(lán)色鏈霉菌的形態(tài)分化,說(shuō)明Lrp家族蛋白在其他產(chǎn)抗生素的放線(xiàn)菌中同樣可以調(diào)控抗生素的生物合成,很可能具有普遍性的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：TQ927

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳杰群;劉文;張嗣良;;紅霉素的生物合成與組合生物合成[J];有機(jī)化學(xué);2012年07期

2 王述安;發(fā)酵過(guò)程中糖的維持濃度與土霉素生物合成的關(guān)系[J];抗生素;1981年01期

3 J·SHVINKA;U.VIEST;M·RUKLISHA;邱志成;;黃色短桿菌賴(lài)氨酸生物合成的產(chǎn)量調(diào)節(jié)[J];發(fā)酵科技通訊;1981年02期

4 謝幸珠,徐京寧,奚建云,周月寶;磷酸鹽對(duì)潔霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)及生物合成潔霉素的影響[J];抗生素;1983年02期

5 戴偉國(guó);種子培養(yǎng)條件對(duì)頭孢菌素生物合成的影響[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1983年04期

6 Malcolm R.Siegel;林蔭年;潘大鈞;;抑制甾醇的殺真菌劑——對(duì)甾醇生物合成的影響和作用部位[J];農(nóng)藥譯叢;1983年01期

7 賀賢國(guó);;~(13)C核磁共振譜與生物合成研究[J];化學(xué)通報(bào);1985年11期

8 三川潮;陳壽松;;穩(wěn)定同位素在生物合成研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];原子能農(nóng)業(yè)譯叢;1985年03期

9 戴偉國(guó);;在實(shí)驗(yàn)裝置中研究振動(dòng)攪拌對(duì)抗生素生物合成的影響[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1986年01期

10 何尊四;;土霉素生物合成調(diào)節(jié)過(guò)程的特性研究[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1986年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姚戈;曹瑛;應(yīng)天翼;陳冀勝;;藍(lán)藻毒素生物合成研究進(jìn)展[A];中國(guó)藻類(lèi)學(xué)會(huì)第八次會(huì)員代表大會(huì)暨第十六次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 閻家麒;魯習(xí)金;;埃博霉素的生物合成[A];2008年中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第八屆中國(guó)藥師周論文集[C];2008年

3 儲(chǔ)炬;胡景;諶頡;莊英萍;張嗣良;;異亮氨酸促進(jìn)阿維菌素生物合成的機(jī)理研究[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨全國(guó)生物反應(yīng)器學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

4 周東坡;平文祥;遲彥;朱婧;趙凱;馬璽;;樹(shù)狀多節(jié)孢生物合成紫杉醇相關(guān)基因的篩選[A];第二屆中國(guó)青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

5 洪高潔;于宗霞;陳曉亞;;紅光促進(jìn)青蒿素生物合成和植物萜類(lèi)次生代謝的機(jī)理研究[A];第三屆全國(guó)植物蛋白質(zhì)組學(xué)大會(huì)摘要集[C];2010年

6 譚華榮;;微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的分子調(diào)控[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

7 唐功利;彭超;蒲津越;宋立強(qiáng);唐滿(mǎn)成;蹇曉紅;;四氫異喹啉生物堿生物合成中新途徑的發(fā)現(xiàn)[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第3分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

8 金以孭;R壏ù，

本文編號(hào)：1754025