本文選題：D-阿洛酮糖 + D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶�。� 參考：《江南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：傳統(tǒng)的甜味劑蔗糖等具有高熱量和致高血糖等缺點(diǎn),過(guò)多的攝入會(huì)導(dǎo)致糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性病的發(fā)生,因此開(kāi)發(fā)新型的低熱量功能性甜味劑已經(jīng)成為國(guó)際食品科學(xué)的研究熱點(diǎn)。近幾年發(fā)現(xiàn)的D-阿洛酮糖是一種新型的功能性甜味劑。作為稀少糖的一種,D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70%左右,而其能量值不到蔗糖的10%。此外,D-阿洛酮糖還具有優(yōu)秀的生理功能,如防齲齒、降低血糖水平、預(yù)防和改善糖尿病以及抑制體內(nèi)脂肪的累積。D-阿洛酮糖已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證為一般認(rèn)為安全(GRAS),并可作為膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。生物酶法是合成D-阿洛酮糖最主要的方法,在D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的催化作用下,D-果糖異構(gòu)化生成D-阿洛酮糖。目前,基因工程菌的不安全性以及抗生素耐藥性已上升到全球化問(wèn)題,選用安全宿主以及構(gòu)建無(wú)抗生素抗性基因的工程菌株是未來(lái)研究的發(fā)展方向。本研究以來(lái)源于Clostridium scindens ATCC 35704的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(DPEase)基因?yàn)檠芯繉?duì)象,構(gòu)建不含抗生素抗性基因表達(dá)DPEase酶的重組枯草芽孢桿菌,為生產(chǎn)食品級(jí)D-阿洛酮糖奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)利用Cre/lox特異性重組系統(tǒng)與重疊延伸PCR相結(jié)合的方法,成功構(gòu)建了D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌1A751(dal-),這種突變菌株無(wú)法在不添加D-丙氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。利用“simple cloning”方法,在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建單啟動(dòng)子重組質(zhì)粒p UB-dpe-dal以及雙啟動(dòng)子重組質(zhì)粒p UB-P43dpe-dal,同時(shí)利用D-丙氨酸消旋酶基因(dal)代替質(zhì)粒中原有的抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌1A751(dal-)中,可復(fù)制質(zhì)粒上的dal基因可互補(bǔ)枯草芽孢桿菌1A751(dal-)染色體上dal基因的缺失,從而起到篩選和維持質(zhì)粒復(fù)制的作用。具有雙啟動(dòng)子的重組枯草芽孢桿菌1A751/p UB-P43dpe-dal的發(fā)酵酶活約為6 U/m L,高于單啟動(dòng)子的重組枯草芽孢桿菌1A751/p UB-dpe-dal的酶活(4.5 U/m L)。收集重組菌1A751/p UB-P43dpe-dal發(fā)酵后的菌體,經(jīng)真空冷凍干燥后,作為酶粉,用于轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖。最佳轉(zhuǎn)化條件為750 g/L的D-果糖溶液,添加2 g/L的凍干酶粉,反應(yīng)1 h可生成178 g/L的D-阿洛酮糖。(2)利用重疊延伸PCR的方法,將枯草芽孢桿菌內(nèi)源啟動(dòng)子P43與dpe基因融合。通過(guò)雙交換整合的方式,將P43-dpe表達(dá)片段與lox71-spc-lox66抗性基因表達(dá)盒一同插入至枯草芽孢桿菌1A751染色體中的淀粉酶基因位點(diǎn),再利用Cre/lox特異性重組系統(tǒng)將染色體中的抗生素抗性基因spc敲除,最終得到無(wú)抗生素抗性基因染色體整合表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的重組枯草芽孢桿菌1A751/P43-dpe,且重組菌的遺傳穩(wěn)定性較好。在P43-dpe表達(dá)片段的兩端引入同尾酶位點(diǎn),利用同尾酶法成功構(gòu)建并篩選得到n個(gè)拷貝數(shù)(包括1,2和3拷貝數(shù))的重組整合質(zhì)粒p DG-ndpe(n=1,2,3),通過(guò)雙交換染色體整合的方式,分別將1,2和3拷貝數(shù)的P43-dpe表達(dá)盒成功插入至枯草芽孢桿菌1A751染色體上,并利用Cre/lox系統(tǒng)將抗生素抗性基因敲除,得到不含抗生素抗性基因的1,2或3拷貝串聯(lián)P43-dpe基因的重組枯草芽孢桿菌1A751-n DPE(n=1,2,3)。重組枯草芽孢桿菌1A751-3DPE的發(fā)酵酶活約為0.75 U/m L,是重組菌1A751-1DPE發(fā)酵酶活的2.2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,增加dpe基因的拷貝數(shù)可以在一定程度上增加其表達(dá)量,從而提高DPEase酶活。通過(guò)對(duì)比四種常見(jiàn)的培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn),重組枯草芽孢桿菌1A751-3DPE在SOC培養(yǎng)基中的發(fā)酵酶活以及總酶活最高,分別為80 U/g菌體和2000U/L發(fā)酵液。重組菌1A751-3DPE全細(xì)胞催化D-果糖異構(gòu)化生成D-阿洛酮糖的最佳條件為300 g/L的D-果糖,添加8 g/L的凍干酶粉,1 h可轉(zhuǎn)化生成60 g/L的D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率約為20%。(3)將目的基因dpe與芽孢衣殼蛋白編碼基因Cot Z相融合,融合基因Cot Z-CL-dpe通過(guò)雙交換染色體整合的方式,以trp C基因作為篩選標(biāo)記,成功整合至枯草芽孢桿菌WB800染色體上,得到不含抗生素抗性基因的重組枯草芽孢桿菌WB800/Cot Z-CL-dpe。此外,DPEase酶通過(guò)α-螺旋連接肽與枯草芽孢桿菌衣殼蛋白Cot Z的C端相連接,以輔助DPEase蛋白酶的折疊,穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。利用饑餓法在DSM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)重組菌WB800/Cot Z-CL-dpe產(chǎn)生孢子,重組孢子經(jīng)過(guò)外加蛋白酶處理后,DPEase酶活明顯下降,說(shuō)明DPEase酶成功展示在枯草芽孢桿菌孢子的表面。研究重組孢子表面展示DPEase的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn),孢子表面展示DPEase酶的最適溫度為55°C,最適p H范圍為7.5~8.0。60°C條件下的重組孢子表面展示DPEase酶的半衰期為170 min,具有較好的耐熱穩(wěn)定性。重組孢子轉(zhuǎn)化D-果糖生成D-阿洛酮糖的最佳條件為:溫度55°C,500 g/L的D-果糖溶液,添加30 g/L的重組孢子。此條件下D-阿洛酮糖的產(chǎn)率為7.1 g/L/h。反應(yīng)12 h后,D-果糖的轉(zhuǎn)化率為17%。重組孢子循環(huán)使用5次后,重組孢子的DPEase酶活基本保持不變,而D-阿洛酮糖的產(chǎn)量下降至最初的60%左右,具有良好的重復(fù)利用性。
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【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS201.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔣嵐,楊永華,龔毅,楊勝利;稀有密碼子對(duì)proUK基因在大腸桿菌中高表達(dá)的影響[J];生物工程學(xué)報(bào);1999年01期

2 湯懋z，

本文編號(hào)：1733980