本文選題：阿維菌素　切入點(diǎn)：細(xì)胞毒性　出處：《華東理工大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：阿維菌素作為生物農(nóng)藥家族最主要的殺蟲劑成員之一,廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域,并在提高農(nóng)作物產(chǎn)量等方面起到了極大的作用。隨著阿維菌素的大量使用,人們對(duì)其毒理學(xué)效應(yīng)的關(guān)注度也越來(lái)越高。作為農(nóng)用殺蟲劑,在殺蟲機(jī)理方面的研究只明確認(rèn)為是一種神經(jīng)毒劑,但確認(rèn)其并非具有唯一的作用靶標(biāo)。同時(shí),國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的報(bào)道說(shuō)明了阿維菌素在環(huán)境暴露中引起的毒性作用,其中大部分研究聚焦于阿維菌素對(duì)施用環(huán)境中非靶標(biāo)生物的毒理學(xué)影響,而鮮見對(duì)人體細(xì)胞的毒性研究。本論文聚焦于阿維菌素的細(xì)胞毒性及分子機(jī)理,針對(duì)以Sf9細(xì)胞為代表的昆蟲體細(xì)胞和以HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞為代表的人體細(xì)胞開展了系統(tǒng)性的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。利用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素具有降低細(xì)胞存活率、抑制細(xì)胞增殖的毒性影響,且對(duì)三種代表細(xì)胞無(wú)顯著的選擇性差異。利用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷和用熒光免疫印跡法對(duì)組蛋白H2AX磷酸化的研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷,并且具體表現(xiàn)為DNA雙鏈斷裂的嚴(yán)重?fù)p傷作用。針對(duì)線粒體及活性氧自由基的研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可以誘導(dǎo)線粒體的腫脹及細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和積累。通過增加抗氧化劑的方法研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素造成的活性氧自由基的產(chǎn)生與積累是引起DNA鏈發(fā)生損傷的主要誘因。在對(duì)阿維菌素引起的DNA損傷中研究發(fā)現(xiàn),DNA鏈上受損堿基與嘌呤或甲酰胺基嘧啶相關(guān);阿維菌素致使DNA受損的過程還引起了8-羥基脫氧鳥苷(8-oxodG)的產(chǎn)生,而該物質(zhì)會(huì)使DNA鏈發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的改變,這種改變具有引起突變和誘發(fā)癌變的潛在毒性。對(duì)DNA損傷監(jiān)控和修復(fù)關(guān)鍵蛋白PARP的試驗(yàn)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),阿維菌素引起了 PARP的被切割,其中24kD多肽和DNA的持續(xù)性結(jié)合將會(huì)導(dǎo)致DNA不能被修復(fù),引起細(xì)胞死亡。而PARP的切割主要來(lái)源于細(xì)胞凋亡過程中caspase3的活化,這預(yù)示著阿維菌素引起DNA損傷后,很可能通過凋亡機(jī)制的啟動(dòng),完成對(duì)細(xì)胞增殖的抑制或者引起細(xì)胞死亡。通過Hoechst染色實(shí)驗(yàn)、AO/EB染色實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)研究證實(shí),阿維菌素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。通過對(duì)線粒體膜電位、細(xì)胞色素C、caspase9、caspase3、Bax/Bcl-2的研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)與線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān);而利用caspase特異性抑制劑抑制caspase3活性后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡比率下降,這也說(shuō)明阿維菌素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有caspase依賴特性。利用透射電子顯微鏡檢測(cè)及MDC染色發(fā)現(xiàn),阿維菌素誘導(dǎo)下的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了典型的自噬特征,而在進(jìn)一步對(duì)自噬發(fā)生標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、p62的試驗(yàn)檢測(cè)中確認(rèn)了自噬的發(fā)生。通過對(duì)細(xì)胞ATP含量的檢測(cè)及對(duì)自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白mTOR、AMPK、p70s6k的磷酸化表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可能通過對(duì)線粒體的損傷作用,降低了細(xì)胞ATP含量從而激活了 AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路,進(jìn)而通過影響下游的p70s6k的磷酸化水平對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活產(chǎn)生影響。針對(duì)昆蟲及人體不同細(xì)胞系,探索阿維菌素的細(xì)胞毒性及分子機(jī)理,有助于揭示阿維菌素的潛在殺蟲機(jī)理,為新農(nóng)藥創(chuàng)制奠定科學(xué)基礎(chǔ);更有助于明確阿維菌素對(duì)人體健康的潛在威脅,為日益凸顯的農(nóng)藥安全問題提供深層次有效評(píng)價(jià)方法。
[Abstract]:As one of the main members of abamectin pesticide bio pesticide family, widely used in agriculture and forestry production areas, and in increasing agricultural productivity has played a great role. With the extensive use of abamectin, the toxicological effects of attention are also increasing. As an agricultural insecticide, on the insecticidal mechanism just think clearly is a nerve agent, but has not only confirmed the target. At the same time, more and more domestic and foreign reports indicate that the toxicity of Abamectin in environment caused by exposure, most of the research focus in the toxicological effects of Abamectin on Application in environment of non target organisms, and the toxicity of rare human cells. This paper focus on the cytotoxicity of avermectin and molecular mechanism for insect cell line by Sf9 cells as the representative and the HeLa cell, He PG2 cells represented human cells carried out in vitro cytotoxicity test system was studied. The formation of experimental study found that using MTT assay and cell cloning, avermectin can reduce the cell survival rate, toxicity effect of inhibiting cell proliferation, no significant differences in selectivity and three representative cells. Using single cell gel electrophoresis to detect DNA damage research and discovery on histone H2AX phosphorylation by fluorescent immunoblotting, abamectin can induce DNA damage, and the specific performance of serious damage effect of DNA double strand breaks. According to the research of mitochondria and active oxygen free radicals that ROS can induce mitochondrial swelling of Abamectin and cell in the production and accumulation. By increasing the research methods of antioxidants, production and accumulation of active oxygen free radicals caused by the avermectin is caused by DN A chain main inducement of injury. The study found that the DNA damage caused by abamectin, DNA chain damaged bases and purine or pyrimidine carboxamides; avermectin causes DNA to the process of damage caused 8- hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG) production, and the material will make the DNA chain space structure change, this change has caused the potential toxicity and mutation induced cancer. Found the test on DNA damage monitoring and repair key protein PARP, abamectin caused a PARP cut, which will cause the DNA cannot be repaired with persistent 24kD polypeptide and DNA, causing cell death. Activation of PARP cutting from Caspase3 in the process of cell apoptosis, which indicates that the DNA damage caused by Abamectin, probably through the mechanism of apoptosis initiation, complete inhibition of cell proliferation or induce cell death. Hoechst staining, AO/EB staining experiment, Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry studies confirmed that abamectin has the ability to induce apoptosis. The potential of mitochondrial membrane, cytochrome C, caspase9, Caspase3, Bax/Bcl-2 study found that avermectin of cell apoptosis is associated with mitochondrial signal transduction pathway and inhibition of Caspase3; activity with specific inhibitors of caspase, decrease the percentage of apoptotic cells, which also shows that the avermectin induced apoptosis with caspase and MDC. The dependence on measured using transmission electron microscopy staining showed that avermectin cells induced by autophagy in typical characteristics, and further to the autophagy marker protein LC3 1 / 2, Beclin1 the test of p62, confirmed the autophagy. Through the detection of cell ATP content and signal transduction pathway related to autophagy. Protein mTOR, AMPK, found on the expression of phosphorylated P70S6K in avermectin may effect on mitochondria by damage, reduce the content of ATP cells to activate autophagy signaling pathway mediated by AMPK/mTOR, and then through the influence of lower the level of phosphorylation of P70S6K on cell growth, proliferation and survival impact. For insects and human body different cell lines and explore the molecular mechanism of cell toxicity and abamectin, helps to reveal the potential Insecticidal Mechanism of avermectin, lay a scientific foundation for the creation of new pesticides; helps clear avermectin a potential threat to human health, provide deep effective evaluation method for pesticide safety problems have become increasingly prominent.

【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ450.26

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本文編號(hào)：1656344