本文選題：阿維菌素　切入點：細胞毒性　出處：《華東理工大學》2017年博士論文

【摘要】：阿維菌素作為生物農(nóng)藥家族最主要的殺蟲劑成員之一,廣泛應用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)領域,并在提高農(nóng)作物產(chǎn)量等方面起到了極大的作用。隨著阿維菌素的大量使用,人們對其毒理學效應的關注度也越來越高。作為農(nóng)用殺蟲劑,在殺蟲機理方面的研究只明確認為是一種神經(jīng)毒劑,但確認其并非具有唯一的作用靶標。同時,國內(nèi)外越來越多的報道說明了阿維菌素在環(huán)境暴露中引起的毒性作用,其中大部分研究聚焦于阿維菌素對施用環(huán)境中非靶標生物的毒理學影響,而鮮見對人體細胞的毒性研究。本論文聚焦于阿維菌素的細胞毒性及分子機理,針對以Sf9細胞為代表的昆蟲體細胞和以HeLa細胞、HepG2細胞為代表的人體細胞開展了系統(tǒng)性的體外細胞毒性實驗進行研究。利用MTT實驗和細胞克隆形成實驗研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素具有降低細胞存活率、抑制細胞增殖的毒性影響,且對三種代表細胞無顯著的選擇性差異。利用單細胞凝膠電泳檢測DNA損傷和用熒光免疫印跡法對組蛋白H2AX磷酸化的研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可以誘導細胞發(fā)生DNA損傷,并且具體表現(xiàn)為DNA雙鏈斷裂的嚴重損傷作用。針對線粒體及活性氧自由基的研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可以誘導線粒體的腫脹及細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和積累。通過增加抗氧化劑的方法研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素造成的活性氧自由基的產(chǎn)生與積累是引起DNA鏈發(fā)生損傷的主要誘因。在對阿維菌素引起的DNA損傷中研究發(fā)現(xiàn),DNA鏈上受損堿基與嘌呤或甲酰胺基嘧啶相關;阿維菌素致使DNA受損的過程還引起了8-羥基脫氧鳥苷(8-oxodG)的產(chǎn)生,而該物質(zhì)會使DNA鏈發(fā)生空間結構的改變,這種改變具有引起突變和誘發(fā)癌變的潛在毒性。對DNA損傷監(jiān)控和修復關鍵蛋白PARP的試驗檢測中發(fā)現(xiàn),阿維菌素引起了 PARP的被切割,其中24kD多肽和DNA的持續(xù)性結合將會導致DNA不能被修復,引起細胞死亡。而PARP的切割主要來源于細胞凋亡過程中caspase3的活化,這預示著阿維菌素引起DNA損傷后,很可能通過凋亡機制的啟動,完成對細胞增殖的抑制或者引起細胞死亡。通過Hoechst染色實驗、AO/EB染色實驗、Annexin V-FITC/PI雙染和流式細胞術研究證實,阿維菌素具有誘導細胞凋亡的能力。通過對線粒體膜電位、細胞色素C、caspase9、caspase3、Bax/Bcl-2的研究發(fā)現(xiàn),阿維菌素對細胞凋亡的誘導與線粒體信號轉(zhuǎn)導途徑相關;而利用caspase特異性抑制劑抑制caspase3活性后,發(fā)現(xiàn)細胞凋亡比率下降,這也說明阿維菌素誘導細胞凋亡具有caspase依賴特性。利用透射電子顯微鏡檢測及MDC染色發(fā)現(xiàn),阿維菌素誘導下的細胞內(nèi)出現(xiàn)了典型的自噬特征,而在進一步對自噬發(fā)生標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、p62的試驗檢測中確認了自噬的發(fā)生。通過對細胞ATP含量的檢測及對自噬信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白mTOR、AMPK、p70s6k的磷酸化表達研究中發(fā)現(xiàn),阿維菌素可能通過對線粒體的損傷作用,降低了細胞ATP含量從而激活了 AMPK/mTOR介導的自噬信號通路,進而通過影響下游的p70s6k的磷酸化水平對細胞的生長、增殖和存活產(chǎn)生影響。針對昆蟲及人體不同細胞系,探索阿維菌素的細胞毒性及分子機理,有助于揭示阿維菌素的潛在殺蟲機理,為新農(nóng)藥創(chuàng)制奠定科學基礎;更有助于明確阿維菌素對人體健康的潛在威脅,為日益凸顯的農(nóng)藥安全問題提供深層次有效評價方法。
[Abstract]:As one of the main members of abamectin pesticide bio pesticide family, widely used in agriculture and forestry production areas, and in increasing agricultural productivity has played a great role. With the extensive use of abamectin, the toxicological effects of attention are also increasing. As an agricultural insecticide, on the insecticidal mechanism just think clearly is a nerve agent, but has not only confirmed the target. At the same time, more and more domestic and foreign reports indicate that the toxicity of Abamectin in environment caused by exposure, most of the research focus in the toxicological effects of Abamectin on Application in environment of non target organisms, and the toxicity of rare human cells. This paper focus on the cytotoxicity of avermectin and molecular mechanism for insect cell line by Sf9 cells as the representative and the HeLa cell, He PG2 cells represented human cells carried out in vitro cytotoxicity test system was studied. The formation of experimental study found that using MTT assay and cell cloning, avermectin can reduce the cell survival rate, toxicity effect of inhibiting cell proliferation, no significant differences in selectivity and three representative cells. Using single cell gel electrophoresis to detect DNA damage research and discovery on histone H2AX phosphorylation by fluorescent immunoblotting, abamectin can induce DNA damage, and the specific performance of serious damage effect of DNA double strand breaks. According to the research of mitochondria and active oxygen free radicals that ROS can induce mitochondrial swelling of Abamectin and cell in the production and accumulation. By increasing the research methods of antioxidants, production and accumulation of active oxygen free radicals caused by the avermectin is caused by DN A chain main inducement of injury. The study found that the DNA damage caused by abamectin, DNA chain damaged bases and purine or pyrimidine carboxamides; avermectin causes DNA to the process of damage caused 8- hydroxydeoxyguanosine (8-oxodG) production, and the material will make the DNA chain space structure change, this change has caused the potential toxicity and mutation induced cancer. Found the test on DNA damage monitoring and repair key protein PARP, abamectin caused a PARP cut, which will cause the DNA cannot be repaired with persistent 24kD polypeptide and DNA, causing cell death. Activation of PARP cutting from Caspase3 in the process of cell apoptosis, which indicates that the DNA damage caused by Abamectin, probably through the mechanism of apoptosis initiation, complete inhibition of cell proliferation or induce cell death. Hoechst staining, AO/EB staining experiment, Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry studies confirmed that abamectin has the ability to induce apoptosis. The potential of mitochondrial membrane, cytochrome C, caspase9, Caspase3, Bax/Bcl-2 study found that avermectin of cell apoptosis is associated with mitochondrial signal transduction pathway and inhibition of Caspase3; activity with specific inhibitors of caspase, decrease the percentage of apoptotic cells, which also shows that the avermectin induced apoptosis with caspase and MDC. The dependence on measured using transmission electron microscopy staining showed that avermectin cells induced by autophagy in typical characteristics, and further to the autophagy marker protein LC3 1 / 2, Beclin1 the test of p62, confirmed the autophagy. Through the detection of cell ATP content and signal transduction pathway related to autophagy. Protein mTOR, AMPK, found on the expression of phosphorylated P70S6K in avermectin may effect on mitochondria by damage, reduce the content of ATP cells to activate autophagy signaling pathway mediated by AMPK/mTOR, and then through the influence of lower the level of phosphorylation of P70S6K on cell growth, proliferation and survival impact. For insects and human body different cell lines and explore the molecular mechanism of cell toxicity and abamectin, helps to reveal the potential Insecticidal Mechanism of avermectin, lay a scientific foundation for the creation of new pesticides; helps clear avermectin a potential threat to human health, provide deep effective evaluation method for pesticide safety problems have become increasingly prominent.

【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ450.26

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