本文選題：黃芩素　切入點：羥基喜樹堿　出處：《大連理工大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：黃酮類化合物是自然界中分布最為廣泛的一類的化合物,普遍存在于水果、蔬菜和中藥中,具有抗氧化、抗炎癥、抗菌和抗病毒等生物功能。研究表明,它們還具有潛在的抗腫瘤活性。但是,目前能夠?qū)嶋H應(yīng)用到臨床治療腫瘤的黃酮類化合物幾乎沒有,究其根本原因是黃酮類化合物的抗癌活性比較低。那么,如何提高黃酮類化合物在抗腫瘤方面的使用價值,是本研究的最終目的。本課題從兩個方面對這一問題進行了探討:一是以黃酮類化合物為輔藥,與羥基喜樹堿聯(lián)合用藥進行抗癌研究;二是以黃酮類化合物為母體,對它進行化學(xué)改造以期得到一種高效低毒的抗腫瘤藥物。主要方法、結(jié)果和結(jié)論如下:(1)首先通過MTT法檢測,發(fā)現(xiàn)低劑量(15.625 μM)的黃芩素能夠顯著的增強羥基喜樹堿對癌細胞如BGC823、MCF7和SMMC7721增殖的抑制作用,可將羥基喜樹堿的使用劑量降低至1/4,聯(lián)用指數(shù)CI～0.4。然后通過Annexin-FITC/PI雙染、PI單染、羅丹明123單染和western blot來探究黃芩素和羥基喜樹堿聯(lián)合作用BGC823細胞48 h后對細胞周期和細胞凋亡的影響,結(jié)果表明:黃芩素和羥基喜樹堿聯(lián)用后顯著增加細胞凋亡數(shù)量、上調(diào)Bax/Bcl-2的比例、加劇線粒體膜電位的下降、增加cleaved-caspase-3/9的含量并剪切PARP-1,但是對pro/cleaved-8的含量沒有影響,說明二者的聯(lián)用是依靠線粒體而非死亡受體途徑來誘導(dǎo)BGC823細胞凋亡;另一方面聯(lián)用組能夠?qū)GC823細胞周期阻滯在G1和G2/M期,并上調(diào)細胞周期抑制蛋白p21和p53的含量。通過彗星實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組能夠增強DNA的損傷。接著,通過DCFH-DA單染、DHE單染和DNA松馳實驗分別研究了 DNA損傷的可能誘因活性氧和拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(Topomerase Ⅰ,Topo Ⅰ)催化活性的變化,結(jié)果表明:黃芩素和羥基喜樹堿聯(lián)用增加了 BGC823細胞中的活性氧含量,但是聯(lián)用組對BGC823細胞的抑制作用并不能被抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸所拮抗,表明二者的協(xié)同作用并不是通過增加活性氧的含量來實現(xiàn);另一方面,低濃度(15.625μM)的黃芩素能夠顯著增強羥基喜樹堿對Topo Ⅰ催化活性的抑制作用,同時高濃度(125μM)的黃芩素本身也能抑制Topo Ⅰ的催化活性,因此推測Topo Ⅰ是黃芩素和羥基喜樹堿的協(xié)同靶點。最后,BGC823細胞裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明,黃芩素(5mg/kg)和羥基喜樹堿(3 mg/kg)聯(lián)用的抑瘤率為67.60±6.56%,而3 mg/kg與9 mg/kg羥基喜樹堿單用組的抑瘤率分別為20.60±5.23%和64.88±5.51%(2)通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)10 μM其他食用類黃酮如槲皮素、芹菜素、木犀草素和白楊素也可以顯著增強羥基喜樹堿對MCF7細胞增殖的抑制作用,可將羥基喜樹堿的使用劑量降低至1/8,聯(lián)用指數(shù)CI0.3。通過DNA松弛實驗、PI單染、Annexin-FITC/PI雙染、羅丹明123染色和western blot等實驗研究了,羥基喜樹堿和槲皮素在乳腺癌MCF7細胞中的協(xié)同抗癌作用,結(jié)果如下:10 μM槲皮素也能夠增強羥基喜樹堿對TopoⅠ催化活性的抑制作用;藥物作用6 h后,0.62 lμ羥基喜樹堿和10 μ槲皮素聯(lián)用組的組蛋白H2A.X上的Ser139的磷酸化開始增加,表明二者的聯(lián)用增強了細胞內(nèi)的DNA損傷;隨著時間的推移(12-24-48 h),聯(lián)用組的細胞周期經(jīng)歷了 G1期阻滯,偏向G2期的S期阻滯和G2/M期的阻滯;細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白ATM和Chk1抑制劑處理MCF7細胞24 h后,再加藥物作用48 h,ATM抑制處理的細胞會對羥基喜樹堿更為敏感但對聯(lián)用組沒有影響,而Chk1抑制劑處理的細胞則對二者都敏感,說明聯(lián)用組的細胞周期阻滯是由ATR-Chk1途徑介導(dǎo)的;聯(lián)用組中p21的含量從藥物作用3 h后就開始顯著增加,而p53的含量是從藥物作用后6h才開始增加的,說明MCF7細胞內(nèi)存在非p53依賴的途徑來介導(dǎo)p21的表達;用p53抑制劑Pifithrina(Pft-a)預(yù)處理的細胞會對羥基喜樹堿更為敏感但對聯(lián)用組沒有影響,表明p53并不會對聯(lián)用組產(chǎn)生抗性;聯(lián)用組在凋亡方面的影響是同黃芩素和羥基喜樹堿聯(lián)用的效果一樣,都是依賴于線粒體途徑而非死亡受體途徑來誘導(dǎo)細胞的凋亡,另外用100μMcaspase廣泛抑制劑預(yù)處理細胞后再加入藥物,聯(lián)用組對MCF7細胞的抑制作用顯著下降,進一步說明了聯(lián)用組是通過凋亡來誘導(dǎo)細胞死亡;MCF7細胞裸鼠移植瘤的實驗表明,盡管1mg/kg羥基喜樹堿和5mg/kg槲皮素聯(lián)用組以常規(guī)方式給藥的藥效弱于瘤旁組,但它的抑瘤率可達到50.16±3.20%,而1 mg/kg與8 mg/kg羥基喜樹堿單用組的抑瘤率分別為25.60 ± 2.20%和57.66 ± 4.50%。(3)以DNA嵌入劑的結(jié)構(gòu)特點設(shè)計并合成了一系列的白楊素衍生物,而后用MTT法檢測它們對腫瘤細胞Hela、BGC823、MCF7、HepG2和正常細胞HEK293的抑制作用,發(fā)現(xiàn)5-(2'-氨基)苯基-7-環(huán)己基甲基白楊素(Ch-1)的抑癌作用最強,尤其是在Hela細胞中呈現(xiàn)斷崖式的抑制作用,而對正常細胞的抑制作用相比較弱。另外,圓二色實驗表明,Ch-1能夠嵌入到DNA中。而后通過Annexin-FITC/PI雙染、羅丹明123單染、PI單染和westem blot等實驗研究Ch-1作用Hela 48 h后對細胞周期和凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):25μM Ch-1將Hela細胞阻滯在G1期;另一方面,25μM Ch-1能夠增加Hela細胞的凋亡、降低pro-caspase-3/8/9的含量、加劇線粒體膜電位的下降、增大Bak/Bcl-2的比例、減少Bid的含量和上調(diào)DR5,表明線粒體和死亡受體途徑都參與了 Ch-1誘導(dǎo)的Hela細胞凋亡;另外,25 μM Ch-1可以顯著上調(diào)p53的含量,且用125μM Pft-a預(yù)處理的Hela細胞對Ch-1的敏感度降低,而且凋亡相關(guān)蛋白的變化也被廢除,表明Ch-1是由p53介導(dǎo)Hela細胞的凋亡。另一方面,2.5-10 μM Ch-1能夠顯著增強羥基喜樹堿對癌細胞增殖和TopoⅠ催化活性的抑制作用;而且,白楊素的其他衍生物也能增強羥基喜樹堿的抑癌作用,且以5-(2'-氨基)苯基白楊素(Ch-3)的增強能力最好。綜上所述,本論文一方面發(fā)現(xiàn)低劑量的黃芩素、槲皮素、芹菜素、木犀草素和白楊素等黃酮類化合物能夠顯著增強羥基喜樹堿的抑癌作用,可將羥基喜樹堿的使用劑量將至1/3之下,并確定二者的協(xié)同靶點是TopoⅠ,為聯(lián)合療法提供了一種新的組合模式;另一方面,以白楊素為前體化合物,合成了一種新型的DNA嵌入劑Ch-1,在Hela細胞中呈現(xiàn)斷崖式的抑制作用,且對正常細胞的殺傷能力較弱,為子宮頸癌的治療提供了一種新的可能性;而且,Ch-1和其他的白楊素衍生物在低劑量下也能顯著增強羥基喜樹堿對癌細胞的抑制作用。
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【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ460.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王宏志;喻春皓;高鈞;趙廣榮;;HPLC分析比較炮制和提取方法對黃芩活性成分的影響[J];中國中藥雜志;2007年16期

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本文編號：1627605