本文關(guān)鍵詞： 原酸酯 pH超敏感 聚乙二醇 乳糖酸 氟化作用 抗腫瘤 藥物傳遞　出處：《安徽大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：對(duì)于臨床上大多數(shù)癌癥的治療,化學(xué)療法是不可替代的治療策略。但化療藥物由于腫瘤選擇性差,導(dǎo)致在臨床上抗腫瘤效果不顯著,同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織或器官產(chǎn)生毒副作用。近些年來聚合物納米藥物傳遞系統(tǒng)的發(fā)展為解決這些問題提供了新的解決途徑,目前經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的納米藥物如PEG化的阿霉素脂質(zhì)體(Doxil/Caelyx)、道諾霉素脂質(zhì)體(DaunoXome)等在臨床上顯著地降低了化療藥物的毒副作用,在整體上提升了病人的存活率。但是其在腫瘤部位的藥物富集能力仍需進(jìn)一步提高。因此,迫切需要研發(fā)一種新型的納米藥物傳遞系統(tǒng)以提高化療藥物在腫瘤部位的靶向富集能力,從而獲得更好的抗腫瘤效果。由于腫瘤組織特殊的理化特性,從血管到腫瘤細(xì)胞存在明顯的pH梯度(血管:～7.4;腫瘤組織胞外酸環(huán)境:～6.5-7.2;內(nèi)涵體:～5.0-6.0;溶酶體:-4.0-5.0),因此,可以通過精確設(shè)計(jì)pH敏感的納米藥物載體來提高抗腫瘤藥物在腫瘤部位的靶向性。目前大多數(shù)的pH響應(yīng)的納米藥物載體主要針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微酸環(huán)境(pH～4.0-6.0),但是這些酸敏感藥物載體依然無法精確區(qū)分腫瘤胞外微酸環(huán)境(pH～6.5-7.2)和正常生理環(huán)境(PH～7.4),從而導(dǎo)致相對(duì)低效的腫瘤靶向性以及不可避免的在正常組織出現(xiàn)藥物分布,也會(huì)導(dǎo)致在腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸刺激響應(yīng)性弱、釋藥緩慢的問題。因此,有必要開發(fā)出pH超敏感的納米藥物載體,使之能夠在血管中穩(wěn)定存在并精確響應(yīng)腫瘤組織微酸環(huán)境,進(jìn)而增強(qiáng)抗腫瘤藥物的靶向性和滅殺能力。與乙縮醛、縮酮、腙鍵等酸敏感鍵相比,原酸酯鍵在微酸條件下的水解速率可以提高1-4個(gè)數(shù)量級(jí)。原酸酯的水解速率極其依賴于其周圍的親疏水環(huán)境,已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)聚合物分子鏈中的原酸酯處于較親水性基團(tuán)環(huán)境中,在pH=5時(shí)候,其完全水解僅需要幾小時(shí);當(dāng)原酸酯處于較疏水性基團(tuán)環(huán)境中,在在pH=5時(shí)候,其完全水解需要數(shù)天時(shí)間。本課題組在前期的研究中,已經(jīng)制備了大量的基于原酸酯的pH敏感納米藥物載體,均表現(xiàn)出良好的生物相容性和微酸響應(yīng)性,其中一些納米粒子在微酸條件下表現(xiàn)出明顯的粒徑變化,鑒于腫瘤組織的的高滲透性和滯留性(EPR效應(yīng)),可以利用這些粒徑變化特性實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤組織的靶向富集�；谝陨涎芯勘尘�,通過精確調(diào)控不同功能基團(tuán)(聚乙二醇、乳糖酸、氟化物)或主鏈鏈長(zhǎng)優(yōu)化原酸酯周圍親疏水環(huán)境,設(shè)計(jì)、制備了一系列基于主鏈聚原酸酯的pH超敏感納米藥物載體,以提高納米藥物載體在腫瘤部位的靶向富集能力。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)通過縮聚以及釀胺反應(yīng)成功合成側(cè)鏈接枝聚乙二醇單甲醚(MPEG)(Mn=550,1000,2000 Da)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-MPEG550,POEAd-g-MPEG1000,POEAd-g-MPEG2000),利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)、三硝基苯磺酸法(TNBS)等對(duì)共聚物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;以POEAd-g-MPEG為基礎(chǔ)制備了空白膠束以及載阿霉素(DOX)膠束,利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)、熒光分光光度計(jì)等對(duì)膠束進(jìn)行表征�？瞻啄z束在不同pH條件下隨時(shí)間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標(biāo)儀跟蹤測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:POEAd-g-MPEG膠束在腫瘤組織微酸條件下具有pH超敏感性,并且具有粒徑動(dòng)態(tài)變化行為:(i)在pH =7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在;(ii)在pH=6.5的條件下粒徑先變小后變大;(iii)在pH=5.5的條件下膠束溶解,快速釋藥。采用MTT法檢測(cè)空白膠束對(duì)人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)和人胚胎腎細(xì)胞系(293T)的細(xì)胞毒性以及載藥膠束對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示空白膠束無細(xì)胞毒性,載藥膠束與DOX細(xì)胞毒性相似。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)三種載藥膠束的細(xì)胞攝取能力進(jìn)行定性和定量評(píng)估,結(jié)果表明載藥膠束的細(xì)胞攝取能力與膠束粒徑以及PEG化程度密切相關(guān)。通過建立體外3D腫瘤模型(SH-SY5Y MCs),分別利用激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡對(duì)載藥膠束的腫瘤滲透以及抑瘤能力進(jìn)行評(píng)價(jià);實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與DOX比較,載藥膠束在12小時(shí)內(nèi)成功滲透到3D多細(xì)胞球體內(nèi)部,并且在3天內(nèi)使組成3D多細(xì)胞球體的腫瘤細(xì)胞全部被殺死,這是目前文獻(xiàn)報(bào)道的體外抗腫瘤活性最好的納米藥物載體。(2)通過縮聚以及接枝反應(yīng)成功合成側(cè)鏈接枝乳糖酸(LA)的聚原酸酯共聚物(POEAd-g-LA20,POEAd-g-LA50,POEAd-g-LA80),利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)、三硝基苯磺酸法(TNBS)等對(duì)共聚物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;以聚合物POEAd-g-LA為基礎(chǔ)制備了空白膠束以及載阿霉素(DOX)膠束(POEAd-g-LA20-DOX,POEAd-g-LA50-DOX,POEAd-g-LA80-DOX),利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)、熒光分光光度計(jì)等對(duì)膠束進(jìn)行表征。空白膠束在不同pH條件下隨時(shí)間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標(biāo)儀跟蹤測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:POEAd-g-LA膠束在腫瘤組織微酸條件下具有pH超敏感性,并且具有粒徑動(dòng)態(tài)變化行為:(i)在pH=7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在;(ii)在pH=6.5的條件下粒徑逐漸變大;(iii)在pH=5.5的條件下膠束快速變大,釋放藥物。采用MTT法檢測(cè)空白膠束對(duì)人肝癌細(xì)胞系(HepG2)和人胚胎腎細(xì)胞系(293T)的細(xì)胞毒性以及載藥膠束對(duì)SH-SY5Y、HepG2、鼠肝癌細(xì)胞系(H22)的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示空白膠束無細(xì)胞毒性;與阿霉素比較,載藥膠束對(duì)肝癌細(xì)胞系的毒性較高或與之近似,但是對(duì)SH-SY5Y的毒性低于裸藥組。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)三種載藥膠束的細(xì)胞攝取能力進(jìn)行定性和定量評(píng)估,結(jié)果表明載藥膠束的細(xì)胞攝取能力在肝癌細(xì)胞系中與DOX相似,但是在SH-SY5Y中低于DOX。結(jié)果暗示膠束表面的乳糖酸能夠顯著提高膠束在肝癌細(xì)胞中的攝取能力。通過建立小鼠體內(nèi)H22肝癌腫瘤模型,以DOX為對(duì)照組測(cè)定載藥膠束在體內(nèi)各個(gè)組織的藥物分布情況以及抑瘤能力;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,POEAd-g-LA20-DOX具有更強(qiáng)的腫瘤富集以及抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力,同時(shí)也證明了其能夠顯著降低對(duì)心臟的毒副作用。(3)為了提高化療效率,具有不同氟化程度的聚原酸酯共聚物通過溫和的縮聚反應(yīng)成功制備,利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)等對(duì)共聚物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;以共聚物為基礎(chǔ)利用乳液蒸發(fā)法制備空白納米微球(POEAd-C3、POEAd-g-F3、POEAd-g-F5)以及載阿霉素納米微球(POEAd-C3-DOX、POEAd-g-F3-DOX、POEAd-g-F5-DOX),利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)等對(duì)納米微球性狀進(jìn)行表征�？瞻准{米微球在不同pH條件下隨時(shí)間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標(biāo)儀跟蹤測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:納米微球?qū)δ[瘤胞內(nèi)外酸環(huán)境具有pH超敏感性并且逐步取得了在在pH =7.4的條件下能夠穩(wěn)定存在,在pH=6.5條件下粒徑發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,在pH=5.5的條件下快速溶解或溶脹,完全釋放藥物。采用MTT法檢測(cè)空白納米微球?qū)epG2和293T的細(xì)胞毒性以及載藥納米微球?qū)H-SY5Y、HepG2、H22的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示空白納米微球無細(xì)胞毒性;POEAd-g-F-DOX對(duì)腫瘤細(xì)胞系的毒性近似于或高于DOX。分別利用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)載藥納米微球的細(xì)胞攝取能力進(jìn)行定性和定量評(píng)估,結(jié)果表明POEAd-g-F-DOX的細(xì)胞攝取能力近似于或高于DOX。結(jié)果暗示氟化的納米微球能夠顯著增強(qiáng)其在腫瘤細(xì)胞中的攝取能力。通過建立體外3D腫瘤模型(SH-SY5Y MCs),分別利用激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡對(duì)載藥膠束的腫瘤滲透以及抑瘤能力進(jìn)行評(píng)價(jià);實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,POEAd-g-F-DOX在12小時(shí)內(nèi)完全占據(jù)整個(gè)MCs,并且在5天內(nèi)使組成3D多細(xì)胞球體的腫瘤細(xì)胞全部被殺死。通過建立小鼠體內(nèi)H22肝癌腫瘤模型,以DOX為對(duì)照組測(cè)定載藥膠束在體內(nèi)各個(gè)組織的藥物分布情況以及抑瘤能力;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,POEAd-g-F-DOX具有更強(qiáng)的腫瘤部位藥物富集能力、抑制腫瘤生長(zhǎng)能力同時(shí)降低了藥物對(duì)正常組織的毒副作用。(4)為了比較納米藥物傳遞系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)外不同的釋藥策略對(duì)抗腫瘤效果的影響,通過溫和的縮聚反應(yīng)成功制備了具有不同鏈長(zhǎng)的聚原酸酯共聚物,利用核磁共振(NMR)、凝膠滲透色譜(GPC)等對(duì)共聚物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征;以共聚物為基礎(chǔ)利用乳液蒸發(fā)法制備空白納米微球(POEAd-C3、POEAd-C6)以及載阿霉素納米微球(POEAd-C3-DOX、POEAd-C6-DOX),利用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)、透射電鏡(TEM)等對(duì)納米微球性狀進(jìn)行表征。空白納米微球在不同pH條件下隨時(shí)間變化的原酸酯降解、粒徑變化以及釋藥行為分別通過1NMR、DLS以及酶標(biāo)儀跟蹤測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:POEAd-C3-DOX在pH=5.5和pH=6.5的條件下具有pH超敏感性,都表現(xiàn)出快速溶液、釋放藥物的行為;而POEAd-C6-DOX只表現(xiàn)出在pH=5.5條件下的刺激響應(yīng)、快速釋放藥物的行為。體外MTT以及細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明在pH =6.5條件下POEAd-C3-DOX更易被腫瘤細(xì)胞攝取并且表現(xiàn)出比POEAd-C6-DOX更強(qiáng)的細(xì)胞毒性,但是體外SH-SY5Y MCs實(shí)驗(yàn)證明POEAd-C6-DOX具有更強(qiáng)的腫瘤滲透和抑瘤能力,并且小鼠體內(nèi)H22肝癌腫瘤模型實(shí)驗(yàn)同樣證明POEAd-C6-DOX具有更強(qiáng)的在腫瘤組織藥物富集、抑瘤能力以及降低對(duì)正常組織毒副作用的能力。因此,從釋藥策略而言,POEAd-C6-DOX的胞內(nèi)釋藥策略表現(xiàn)出更強(qiáng)的整體性抗腫瘤效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R943;R96

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本文編號(hào)：1447585