本文關(guān)鍵詞：生理工程策略提升乳酸菌γ-氨基丁酸合成效率的研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸,具有多種重要的生理功能,在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。通過益生性乳酸菌催化生產(chǎn)GABA已是人們目前普遍共識。然而,理解乳酸菌中GABA合成途徑及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制是強(qiáng)化乳酸菌作為細(xì)胞工廠高效生產(chǎn)該物質(zhì)的前提。本文以課題組從鮮牛奶中分離得到的一株GABA高產(chǎn)菌株短乳桿菌(Lactobacillus brevis CGMCC 1306)為出發(fā)菌株,在解析其谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)(GAD system)表達(dá)調(diào)控機(jī)制及關(guān)鍵蛋白催化特性,分析菌株GAD系統(tǒng)、FlFo-ATPase質(zhì)子泵、胞內(nèi)微環(huán)境及耐受酸脅迫之間關(guān)系的基礎(chǔ)上,采用生理工程策略通過代謝工程與合成生物學(xué)手段強(qiáng)化乳酸菌GAD代謝途徑、調(diào)控胞內(nèi)微環(huán)境及細(xì)胞膜通透性,實現(xiàn)了高產(chǎn)工程菌株及混合發(fā)酵體系的構(gòu)建與GABA的高效合成。主要結(jié)果如下:(1)建立了短乳桿菌遺傳操作方法,通過實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)和基于溫敏性pGhost4系統(tǒng)的染色體無痕敲除技術(shù)等手段解析了Lb.brevis CGMCC 1306染色體上gad operon的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控機(jī)制,并探討了GAD系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞抵御酸脅迫及GABA合成過程中的作用。研究表明:Lb.brevis CGMCC 1306含有兩個谷氨酸脫羧酶基因,其中g(shù)adB與其上游的gadR及gadC連鎖并以基因簇gadRCB形式存在于染色體上;gadA遠(yuǎn)離該基因簇單獨出現(xiàn)在染色體上;gadC與gadB形成gadCB operon,共同轉(zhuǎn)錄和表達(dá);gadR單獨轉(zhuǎn)錄表達(dá),并陽性調(diào)控gadCB operon的轉(zhuǎn)錄,為促進(jìn)因子。gadCB operon所編碼的蛋白是該菌株GAD活性的主要提供者,對細(xì)胞抵御酸脅迫起到了重要的作用。(2)建立了基于比色法的高GAD活性菌株高通量篩選方法,并成功獲取了兩株FlFo-ATPase活性弱化但GAD活性增強(qiáng)的Lb.brvis突變菌株。分析了FlFo-ATPase活性弱化菌株與對照菌株胞內(nèi)微環(huán)境的差異,為理解GAD活性增強(qiáng)的原因和采用生理工程策略改造菌株提升GABA合成效率提供了理論支撐。結(jié)果顯示:Lb.brvis的GABA合成過程與細(xì)胞內(nèi)外pH、細(xì)胞膜FoFl-ATPase活性及菌株GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白催化性能之間存在著緊密關(guān)系。在適宜的酸脅迫條件下過量表達(dá)GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白并適當(dāng)弱化FlFo-ATPase活性,能夠有效促進(jìn)Lb.brevis生產(chǎn)GABA的性能。其中,基于上述理論所獲取的重組菌株Lb.brevis/pMG36e-gadA的FlFo-ATPase缺陷突變株Lb.brevis NRA6具有相對較高的GAD活性�？厮�(pH 5.2)厭氧批次發(fā)酵條件下,該工程菌株在48 h內(nèi)可累積GABA至43.65 g/L,轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.42%;為野生菌株的1.22倍。(3)通過篩選并理性改造來源于植物乳桿菌的谷氨酸脫羧酶(LpGadB),獲得了 C-末端截短的但具有相對更寬泛催化pH范圍的LpGadB突變體LpGadB△C11。在此基礎(chǔ)上,基于生理工程策略合理組合GAD系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白及突變體并強(qiáng)化其表達(dá),有效促進(jìn)了Lb.revis的GABA合成效率。其中,重組菌株Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC在分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中,72 h可有效產(chǎn)生GABA高達(dá)104.38 g/L,為野生菌株的1.28倍。與此同時,采用上述策略并以乳酸菌模式菌株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis NZ9000)為出發(fā)菌株,進(jìn)一步構(gòu)建了目標(biāo)菌株Lc.lactis NZ9000/pNZ8148-LpgadB△11-LcgadC,并考察了其GABA合成性能。自然發(fā)酵條件下,在含有60 g/LMSG的GM17發(fā)酵培養(yǎng)基中,36 h時該重組菌株GABA產(chǎn)量達(dá)18.94 g/L;而采用兩階段pH調(diào)控策略進(jìn)一步有效增強(qiáng)了菌株GABA合成效率,發(fā)酵36 h時,GABA產(chǎn)量積累至30.89 g/L,為自然發(fā)酵條件下產(chǎn)量的1.63倍;而48 h發(fā)酵結(jié)束時,GABA產(chǎn)量高達(dá)32.16 g/L,轉(zhuǎn)化率為87.92%,為目前基于乳酸乳球菌細(xì)胞批次發(fā)酵生產(chǎn)GABA所報道的最高水平。(4)通過合成生物學(xué)手段建立了基于溫和型乳球菌噬菌體(lactococcal bacteriophage rlt)裂解盒(LytHA)與糞腸球菌(Ec.faecalis LMG 2333)細(xì)菌素(EnlA)的乳酸菌混合發(fā)酵體系中可控裂解平臺工程菌株。實現(xiàn)了共培養(yǎng)體系中Lc.lactis細(xì)胞的可控裂解及Lb.brevis細(xì)胞膜的透性化,有效削弱了 GABA合成過程中Glu/GABA跨膜運(yùn)輸阻力,進(jìn)一步提升了重組Lc.lactis及Lb.brevis細(xì)胞合成GABA的效率。在Lc.lactics NZ9000/pNZ8148-LcgadB與pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB的混合催化體系中,36 h時GABA濃度達(dá)37.64 g/L;而在 pNZ8148-enlA-PpepN-LcgadB與Lb.brevis LpGadB△C11-LbGadC 的混合發(fā)酵體系中,48 h后GABA產(chǎn)量高達(dá)126.85 g/L。
[Abstract]:On the basis of analyzing the relationship between the expression of glutamic acid decarboxylase system ( GAD system ) , the regulation of intracellular microenvironment and cell membrane permeability , the mechanism of intracellular microenvironment and cell membrane permeability was analyzed by means of metabolic engineering and synthetic biology . A high - throughput screening method for GAD active strain based on colorimetric method was established . The mutant strain Lb . brvis was successfully obtained by screening and rational transformation of key protein and mutant strain LpGadB 鈻，

本文編號：1418121