本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)富集與活性分析的質(zhì)譜新方法研究　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蛋白質(zhì)是生命體系的功能執(zhí)行者,其活性與其自身狀態(tài)密切相關(guān)。其中,翻譯后修飾作為蛋白質(zhì)活性最為普遍的調(diào)控方式,在生命體中廣泛存在,并保證物質(zhì)運(yùn)輸、遺傳物質(zhì)復(fù)制、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各項(xiàng)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。因此,系統(tǒng)性地探索蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程并分析其活性,有助于進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)于揭示疾病與蛋白活性的關(guān)系,開發(fā)臨床診斷和治療方法等具有重要意義。本論文以質(zhì)譜平臺(tái)為基礎(chǔ),結(jié)合納米、編碼、微陣列以及質(zhì)譜成像等技術(shù),合成了一種新型功能化材料,用于糖基化多肽的快捷分離和選擇性富集;利用多肽編碼技術(shù)構(gòu)建質(zhì)譜芯片,發(fā)展了一系列用于多種酶活性檢測的方法。論文主要包括以下五個(gè)部分:1.糖基化多肽的浮力分離和選擇性富集制得巰基苯硼酸修飾的金納米粒子@二氧化硅浮球(MPB-Au@SiBs),并將其用于糖肽的浮力分離和選擇性富集。MPB-Au@SiBs的合成采取分步法,條件溫和,步驟簡單,相比其它材料,浮力分離過程方便快捷�；谔请纳享樖搅u基與硼酸基團(tuán)可逆的共價(jià)結(jié)合,用該材料捕獲糖肽,隨后在酸性條件下釋放并進(jìn)行質(zhì)譜檢測。MPB-Au@SiBs具有較好的富集容量、富集靈敏度和選擇性,它簡化了糖肽從復(fù)雜樣品中的分離步驟,為糖蛋白組學(xué)分析提供了新工具。2.微孔板多肽編碼用于蛋白酶活性的MALDI-TOF MS定量分析設(shè)計(jì)出多肽編碼微孔板,用于蛋白酶活性的MALDI-TOFMS分析。所設(shè)計(jì)的多肽編碼由編碼區(qū)域和供蛋白酶剪切的底物區(qū)域構(gòu)成,在被目標(biāo)蛋白酶剪切后,編碼區(qū)域由微孔板釋放;以序列差別一個(gè)氨基酸的多肽作為內(nèi)標(biāo),建立了酶活性檢測的質(zhì)譜定量分析方法,并以胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)作為模型驗(yàn)證了多種蛋白酶定量分析的可行性。該多肽編碼微孔板具有良好的選擇性,為多種蛋白酶的種類鑒定和活性分析提供了新手段。3.高分辨質(zhì)譜法測定多酶活性為驗(yàn)證上一章中MALDI-MS的定量分析技術(shù),將多肽編碼策略用于多種蛋白酶活性的高分辨質(zhì)譜(HRMS)分析。該方法具有更高的靈敏度,無需內(nèi)標(biāo)即實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白酶活性的準(zhǔn)確定量,在臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。4.含硒多肽同位素策略用于酶活性的高可信度質(zhì)譜分析為簡化復(fù)雜體系中酶反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定過程并獲取具有較高可信度的分析數(shù)據(jù),發(fā)展了含硒多肽-高分辨質(zhì)譜方法(SePeps-HRMS),并用于酶活性研究。將硒代蛋氨酸(SeMet)引入多肽底物,并與生物樣品孵育反應(yīng),相關(guān)底物和產(chǎn)物在質(zhì)譜全掃描模式下即可根據(jù)硒元素特殊的同位素分布特征被迅速辨別,無需進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。由于對(duì)每條多肽而言,其固有的同位素比例如同其獨(dú)一無二的"簽名",通過比較同位素峰面積比值的實(shí)驗(yàn)值與理論值即可排除微小質(zhì)量差異的干擾,提高定量分析的可信度。以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)和尿纖溶蛋白激活因子(uPA)為模型對(duì)方法進(jìn)行了可行性驗(yàn)證。該方法有望成為高通量酶活性分析的有力工具,并可擴(kuò)展應(yīng)用于多酶相互作用以及底物篩選的相關(guān)研究。5.Caspase酶活性的MALDI-MS成像分析及其應(yīng)用為獲得更為直觀的高通量酶活性分析結(jié)果,發(fā)展了 MALDI-MS成像分析技術(shù),實(shí)現(xiàn)了多種酶活性的便捷可視化檢測。方案以磷脂分子修飾多肽底物,利用其兩親性的特征保證了它在疏水玻片表面的有序組裝,通過構(gòu)建模擬生物膜,增強(qiáng)了 MALDI芯片表面的生物相容性,以使待測酶更易接近其底物。同時(shí)這一設(shè)計(jì)增加了酶反應(yīng)產(chǎn)物的分子量,可以避免基質(zhì)與生物樣品中雜質(zhì)的十?dāng)_,改善了檢測信噪比與質(zhì)譜分辨能力。實(shí)驗(yàn)選擇含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族(Caspase-1,-2,-3和-8)為模型,將相應(yīng)多肽底物分別與磷脂骨架分子連接并組裝于疏水玻片表面,制備出用于酶活性檢測的陣列芯片。在目標(biāo)酶的作用下,底物被剪切產(chǎn)生質(zhì)量位移,各酶的活性通過酶切產(chǎn)物的質(zhì)荷比進(jìn)行顏色編碼,實(shí)現(xiàn)了多種酶活性的可視化與高通量定量檢測。這一方法可用于Caspase家族抑制劑的篩選和化療過程中癌細(xì)胞內(nèi)一系列Caspase酶活性變化的監(jiān)測,為耐藥性細(xì)胞鑒別及抗癌藥物篩選提供了有力工具,并可方便地?cái)U(kuò)展應(yīng)用于其它酶體系,為探究更多生命過程中酶的作用機(jī)制提供了新途徑。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O629.73;O657.63

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