本文關(guān)鍵詞：大豆乳清蛋白與多糖的復合作用以及蛋白質(zhì)組分的選擇性提取

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【摘要】：蛋白質(zhì)-多糖相互作用導致的選擇性復合現(xiàn)象,是一種獨特的分離純化蛋白的方法。大豆乳清是大豆分離蛋白生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,將其中的蛋白質(zhì)回收利用不僅有利于大豆的綜合利用,還能減少環(huán)境污染。本課題從動力學和熱力學角度研究天然帶電多糖與大豆乳清蛋白的選擇性復合行為,并且對蛋白-多糖復合物的形成機理和控制因素進行詳細考察。主要研究結(jié)論如下:首先,論文研究了天然陽離子多糖殼聚糖(Ch)與大豆乳清蛋白(SWP)的復合行為,并選擇性純化Kunitz胰蛋白酶抑制劑(KTI)。通過控制體系pH達到最大程度復合(pHmax),獲得的復合物總量最多,蛋白含量最高,并在蛋白多糖/質(zhì)量比4:1,pH 6.3條件下獲得最高回收率(32%)。Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明,四種大豆乳清蛋白中,KTI和Bowman-Birk胰凝乳蛋白酶抑制劑(BBI)參與了復合物形成,而β-淀粉酶和大豆凝集素(SBA)基本不參與,這與殼聚糖較高的p Ka值有關(guān)。進一步增加蛋白/多糖質(zhì)量比至100:1,僅有KTI參與復合物形成,BBI仍然殘留于上清中。最終,經(jīng)過以上與殼聚糖的選擇性復合作用,可以從大豆乳清中回收90%以上的KTI,KTI平均純度為90%(SEC-HPLC),胰蛋白酶抑制活性(TIA)為5901.3 U/mg。再者,研究了天然陰離子多糖ι-卡拉膠與大豆乳清蛋白的選擇性復合行為,并純化KTI、BBI和大豆凝集素(SBA)。在大豆乳清蛋白/卡拉膠質(zhì)量比≥5:1條件下,卡拉膠優(yōu)先與KTI和SBA形成復合物,復合完成后,剩余的卡拉膠分子才開始復合BBI和β-淀粉酶。最終,控制蛋白/多糖質(zhì)量比為15:1,pHmax為pH 3.57及pH 4.48,可以分別制備得到純度90%的KTI和SBA。與此同時,調(diào)節(jié)蛋白/多糖質(zhì)量比為10:1,pHmax 3.69,可以制備得到純化的BBI(純度約為92.5%),胰凝乳蛋白酶抑制活性(CIA)為690 U/mg。等溫滴定量熱(ITC)表明,SBA對卡拉膠的親和常數(shù)(43.1±13.1×106 M-1)高于β-淀粉酶(8.39±1.55×106 M-1),而KTI對卡拉膠的親和常數(shù)(14.5±4.03×106 M-1)高于BBI(4.05±1.13×106 M-1)。其次,研究了多糖類型對大豆乳清蛋白選擇性復合影響。以KTI-BBI混合物(KBM)為模型體系,詳細考察了羧基多糖和硫酸多糖形成復合物的差異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),羧基多糖形成的復合物表現(xiàn)復凝聚物結(jié)構(gòu),而硫酸多糖形成的復合物更類似于“沉淀”,這是因為硫酸多糖電荷密度更高。另外,研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)多糖電荷密度的大小,純化BBI所需的多糖相對質(zhì)量不斷升高。硫酸葡聚糖具有最高的電荷密度,因此純化BBI的多糖用量最少(蛋白/多糖質(zhì)量比10:1);λ-卡拉膠、硫酸軟骨素、海藻酸鈉電荷密度中等,在蛋白/多糖質(zhì)量比5:1時實現(xiàn)BBI純化;黃原膠電荷密度較低,需要的多糖用量最多(蛋白質(zhì)/多糖質(zhì)量比達到2:1)。阿拉伯膠具有最低的電荷密度,蛋白回收率僅為38.1%,KTI和BBI的分離度較低,不能實現(xiàn)選擇性純化BBI。從熱力學角度研究了BBI與ι-卡拉膠的熱力學結(jié)合行為。ITC結(jié)果表明,BBI與ι-卡拉膠的熱力學結(jié)合分為兩步結(jié)合過程,即放熱焓(-ΔH)逐漸增加和逐漸衰減過程。臨界摩爾濃度rcritical=400,不受蛋白摩爾濃度、鹽濃度和溫度的影響,并且靜電作用力和非靜電作用力(例如疏水作用力)共同參與了蛋白多糖結(jié)合過程。BBI結(jié)合多種硫酸多糖同樣形成兩步熱力學曲線;BBI結(jié)合多種羧基多糖卻只能形成典型熱力學飽和曲線。將ι-卡拉膠進行酸水解,破壞硫酸基團,水解片段結(jié)合卡拉膠分子形成了正常的飽和S型熱力學曲線,兩步熱力學曲線消失。由此可知,BBI ι-卡拉膠熱力學結(jié)合是一種硫酸基團依賴型行為。利用殼聚糖(Ch)-卡拉膠(CG)兩步復合法從實際生產(chǎn)中的大豆乳清體系選擇性純化蛋白。在低聚糖、非蛋白氮、小肽和礦物鹽等物質(zhì)的存在下,殼聚糖與大豆乳清的復合作用強度顯著降低,需要完全轉(zhuǎn)移胰蛋白酶抑制劑所需的殼聚糖用量達到蛋白含量的50%,遠高于透析大豆乳清蛋白所需的殼聚糖用量(5%)。殼聚糖分子量的增加可以進一步增加蛋白回收率,蛋白多糖結(jié)合常數(shù)(Ksv)按照分子量大小依次降低。控制ChSWP復合物與卡拉膠進行第二步復合,KTI和BBI表現(xiàn)出競爭性的結(jié)合行為,KTI優(yōu)先與卡拉膠(ι-,κ-)結(jié)合并轉(zhuǎn)移至復合物中,在蛋白質(zhì)/多糖質(zhì)量比3:1條件下,純化的BBI被富集于上清中。最終制備得到的BBI純度約為92.7%,CIA為669.5 U/mg。最后,利用多種高濃度(4%)陰離子多糖回收大豆乳清蛋白,并組裝了剪切裝置。結(jié)果表明,ι-卡拉膠和硫酸葡聚糖最適合回收大豆乳清蛋白,最佳回收條件為:大豆乳清蛋白/ι-卡拉膠濃度比2:1,pH 3.5,大豆乳清蛋白/硫酸葡聚糖濃度比3:1,pH 3.5,蛋白回收率分別為91%和89.2%。激光共聚焦顯微技術(shù)(CLSM)觀察了剪切前后蛋白質(zhì)-多糖復合物結(jié)構(gòu)的差異性。剪切前,高濃度多糖與蛋白形成的復合物微觀結(jié)構(gòu)分布不均一。剪切后,ι-卡拉膠和硫酸葡聚糖與蛋白形成的復合物為明顯的聚集體形態(tài)(≥100μm),數(shù)量較多;海藻酸鈉和黃原膠形成的復合物呈絮狀或絲綿結(jié)構(gòu),無聚集體粒子;阿拉伯膠和羧甲基纖維形成的復合物粒子十分微小,或者不存在,無法形成相分離。利用小規(guī)模超濾裝置成功分離了蛋白與多糖。實驗表明,采用截留分子量為100 k Da的超濾裝置,可以截留超過90%的多糖,同時透過75% 80%的蛋白分子。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS201.21

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本文編號：1294150