本文關(guān)鍵詞：銀杏葉類脂的分離、制劑制備及生物活性研究

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【摘要】：銀杏葉類脂(GL)是銀杏葉(GBL)中重要的脂溶性生物活性物,其中的聚戊烯醇(PPs)與人體多萜醇結(jié)構(gòu)相似,具有預(yù)防高血壓、抗腫瘤、護(hù)肝,治療老年癡呆等功效,目前尚未開發(fā)利用。因此,本文采用細(xì)胞破壁技術(shù)輔助提取GL,利用配位原理合成具有定向選擇性的用于純化GL的新型材料,以此獲得高純度PPs,并通過制備GL脂質(zhì)體和凝膠劑來考察這兩種藥物制劑的生物活性,為新藥開發(fā)以及功能性食品和化妝品的研制提供一定的理論指導(dǎo)。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:(1)破壁技術(shù)輔助提取GL的工藝優(yōu)化對(duì)比酶法輔助超聲和機(jī)械化學(xué)法兩種細(xì)胞破壁技術(shù)提取GL的效果,并優(yōu)化提取工藝。酶法輔助超聲提取GL的最優(yōu)工藝為:加酶量0.50 g(纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量比為1:2,酶活60 U/mg)、超聲溫度45℃、酶解pH為4.50,在此工藝條件下,PPs的含量可達(dá)0.80%。機(jī)械化學(xué)法提取GL最優(yōu)工藝為:氫氧化鈉濃度為30%,固液比1:15,提取溫度80℃,提取時(shí)間4 h,在此最優(yōu)工藝條件下,PPs的含量可達(dá)0.81%。這兩種方法均能從根源上提高PPs的得率,但是考慮到機(jī)械化學(xué)法中產(chǎn)生的堿液不易處理,因此,選擇酶法輔助超聲作為GL的提取方法。(2)酶解液中水溶性成分的分離及功能特性酶解液中的水溶性成分主要由多糖和蛋白質(zhì)組成。采用無水乙醇沉淀酶解液多糖,然后通過DEAE纖維素柱層析和G-100凝膠柱層析分離得到GBP11,GBP22和GBP33三種多糖單體,其分子量分別為1.94×103 kDa、5.17×103 kDa和46.0 kDa,并且這三種多糖均主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成,其摩爾比例分別為62.2:2.0:3.8:1.2、3.6:68.0:4.7:0.4和5.3:48.8:1.7:9.0。采用殼聚糖沉淀酶解液中蛋白質(zhì),然后通過活性炭脫色和透析技術(shù)純化獲得純度為90.4%的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)具有較好的溶解度、持水持油性以及乳化性和乳化穩(wěn)定性。(3)破壁輔助提取前后GBL的理化性質(zhì)變化規(guī)律采用SEM、TG,HPLC和Py-GC-MS技術(shù)考察了破壁輔助提取前后GBL的理化性質(zhì)變化規(guī)律,包括PPs含量、細(xì)胞壁外觀形貌,裂解產(chǎn)物組成和熱穩(wěn)定性等。SEM試驗(yàn)結(jié)果表明,未經(jīng)細(xì)胞破壁處理的GBL細(xì)胞壁表面光滑,并且細(xì)胞壁相鄰孔洞之間排列緊密,而破壁輔助提取后GBL的細(xì)胞壁表面結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,大量的孔洞出現(xiàn),并且相鄰孔洞之間排列疏松。TG試驗(yàn)結(jié)果表明,與未經(jīng)破壁處理的GBL相比,破壁輔助提取后的GBL更易于進(jìn)行熱分解,熱穩(wěn)定性降低;此外,破壁提取前后GBL的熱分解機(jī)理均為隨機(jī)成核和隨后生長(zhǎng)反應(yīng)控制機(jī)制,符合Avrami-Erofeev方程。HPLC試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)破壁輔助提取后的GBL中幾乎未檢測(cè)出PPs的存在。Py-GC-MS試驗(yàn)結(jié)果表明,破壁輔助提取后GBL中12個(gè)碳以下的小分子化合物主要由水溶性成分組成,其總GC含量在破壁輔助提取后顯著減少;12~20個(gè)碳的化合物主要為低極性物質(zhì),破壁輔助提取后其總GC含量的變化根據(jù)破壁輔助輔助提取技術(shù)的不同而不同。(4)GL純化材料的合成及表征合成和表征了巰基/離子液體改性納米二氧化硅固載銀離子新型材料,并利用新型材料對(duì)GL進(jìn)行了分離純化,考察了分離純化過程中的吸附動(dòng)力學(xué),吸附等溫線和吸附機(jī)理。IR試驗(yàn)結(jié)果表明,新型材料中未出現(xiàn)羥基特征吸收峰,說明巰基和離子液體已經(jīng)成功枝接到納米二氧化硅上。SEM試驗(yàn)結(jié)果表明,與納米二氧化硅相比,新型材料的團(tuán)聚現(xiàn)象明顯減弱,且顆粒度之間的分散性更好。XRD試驗(yàn)結(jié)果表明,化學(xué)改性對(duì)納米二氧化硅的結(jié)構(gòu)有一定的影響,但影響較小。吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,新型材料對(duì)GL的吸附在7 min左右基本上達(dá)到吸附平衡,其吸附量為83.4 mg/g,吸附符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)。以新型材料為固定床對(duì)GL進(jìn)行分離,PPs的含量由43.9%上升到80.8%。吸附熱力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,新型材料對(duì)GL的吸附是放熱反應(yīng),低溫有利于增加吸附量。此外,新型材料對(duì)PPs標(biāo)準(zhǔn)品的吸附要明顯好于對(duì)GL的吸附。(5)GL的熱解特性及機(jī)理研究對(duì)GL和PPs標(biāo)準(zhǔn)品在熱解過程中的熱穩(wěn)定性、化學(xué)鍵斷裂情況,熱解動(dòng)力學(xué)和熱解機(jī)理進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,GL較穩(wěn)定,268.3℃之后才開始劇烈分解,且隨著反應(yīng)的進(jìn)行,甲基、亞甲基、游離的醇或酚、芳香族化合物,烯烴和酯的含量不斷增加,但是由于GL熱解不規(guī)律,因此無法對(duì)其熱解動(dòng)力學(xué)和熱解機(jī)理進(jìn)行分析;PPs標(biāo)準(zhǔn)品很穩(wěn)定,在347.4℃之前,其質(zhì)量損失不大,347.4℃之后才開始劇烈分解,并且隨著熱反應(yīng)的進(jìn)行,甲基、CO2、不飽和碳?xì)滏I、烯基、累積碳碳雙鍵,碳碳雙鍵和羥基的含量不斷增加。此外,PPs的熱解過程屬于一級(jí)化學(xué)反應(yīng),其熱解動(dòng)力學(xué)表達(dá)式為:dα/dT=2.231×1013e(-20712/T)(1-α)/β。(6)GL納米銀制劑的制備及表征采用薄膜分散法制備了GL脂質(zhì)體和PPs脂質(zhì)體,確定了制備GL脂質(zhì)體的最優(yōu)的工藝條件為:卵磷脂∶膽固醇(m/m)=3:1,空白脂質(zhì)體:GL溶液(m/v)=10:1,超聲時(shí)間30 min;PPs脂質(zhì)體的最優(yōu)的工藝條件為:卵磷脂∶膽固醇(m/m)=3:1,PPs脂質(zhì)體:PPs溶液(m/v)=5:1,超聲時(shí)間30 min。并且,在此基礎(chǔ)上制備了納米銀GL脂質(zhì)體、納米銀PPs脂質(zhì)體,納米銀GL凝膠劑和納米銀PPs凝膠劑,其平均粒徑分別為397 nm、1114 nm、3223 nm和5940 nm。制備的納米銀脂質(zhì)體和凝膠劑的物理穩(wěn)定性均良好,且貯藏穩(wěn)定性均高于其相對(duì)應(yīng)的溶液的穩(wěn)定性。此外,納米銀GL脂質(zhì)體和納米銀PPs脂質(zhì)體還具有較好的緩釋作用。(7)GL及其制劑的生物活性研究考察了GL不同極性部位的抗氧化能力,以及制備的納米銀脂質(zhì)體和凝膠劑的抑菌活性�？寡趸囼�(yàn)結(jié)果表明,濃縮物C對(duì)DPPH具有較強(qiáng)的清除能力,集分3對(duì)ABTS和羥自由基顯示出較強(qiáng)的清除活性,PPs標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除能力。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明,制備的四種納米銀脂質(zhì)體和凝膠劑均對(duì)四種菌具有一定的抑制效果,其中,對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好,其次分別是金黃色葡萄球菌,肺炎鏈球菌和白色念珠菌。納米銀GL凝膠劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,白色念珠菌和肺炎鏈球菌抑菌效果最好,其抑菌圈范圍為12.0~21.4 mm,MBC和MIC值范圍依次為0.5~64μg/mL和16~256μg/mL。此外,納米銀GL脂質(zhì)體和凝膠劑的抑菌活性強(qiáng)于納米銀PPs脂質(zhì)體和凝膠劑,這可能與GL中非PPs成分與PPs協(xié)同抑菌作用有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ464

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8 李s沆

本文編號(hào)：1287355