本文關(guān)鍵詞：基于超支化大分子的多功能納米平臺(tái)的構(gòu)建及其基因治療應(yīng)用

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【摘要】：分子生物學(xué)和納米技術(shù)的快速發(fā)展,極大推動(dòng)了納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用,并在基因傳遞、光熱治療、藥物輸送及醫(yī)學(xué)成像等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。為實(shí)現(xiàn)納米技術(shù)在疾病治療中的廣泛應(yīng)用,開(kāi)發(fā)安全、穩(wěn)定和高效的功能化納米材料顯得至關(guān)重要。各種納米材料,包括脂質(zhì)體、超支化大分子和天然高分子聚合物等已成為目前研究的熱點(diǎn)。其中,超支化大分子因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn),不僅為先進(jìn)功能化的超支化大分子納米材料的構(gòu)建提供了理論依據(jù),還為疾病治療新手段的探索提供了新思路。為了優(yōu)化超支化大分子(第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子(G5.NH2)或聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI))的生物相容性、提高載體的基因轉(zhuǎn)染效率、增強(qiáng)材料的腫瘤殺傷效果,本論文以超支化大分子作為平臺(tái),構(gòu)建了一系列基于超支化大分子的納米顆粒用于疾病的生物學(xué)治療,具體做了以下研究工作:一、RGD多肽功能化樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒負(fù)載hBMP-2 pDNA用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因治療;二、功能化樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒負(fù)載治療性siRNA用于人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因治療;三、樹(shù)狀大分子修飾的MoS_2納米片用于腫瘤的基因和光熱治療;四、多功能化聚乙烯亞胺包裹的金納米顆粒負(fù)載siRNA用于腫瘤的基因治療。本文對(duì)制備的功能化超支化大分子進(jìn)行系統(tǒng)性研究,一方面,積極探索基于樹(shù)狀大分子的納米顆粒在多種基因治療,甚至在光熱治療上的潛力;另一方面,開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉,可替代樹(shù)狀大分子的超支化大分子,為制備新型多功能納米材料提供新的思路和發(fā)展方向。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:1)第二章中,我們合成了RGD多肽修飾的聚乙二醇化樹(shù)狀大分子包裹的金納米顆粒。具體首先通過(guò)聚乙二醇鏈將靶向分子rgd連接到第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子表面,再將mpeg部分修飾到其表面,以rgd多肽修飾的聚乙二醇化樹(shù)狀大分子為模板,通過(guò)硼氫化鈉快速還原法,按照au/g5.nh2=25的投料摩爾比,合成最終的audenps。所制備的aunps粒徑為1.9-2.1nm,且分布均勻,大小均一。在n/p比大于等于1的時(shí)候,能成功將pdna完全的包裹,在此基礎(chǔ)上選擇n/p比1~5進(jìn)行后續(xù)的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。audenps復(fù)合egfplucpdna轉(zhuǎn)染干細(xì)胞,通過(guò)熒光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)可得出,n/p比為2.5的時(shí)候,材料具有最高的熒光素酶表達(dá)量,而k4具有最強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)染效率,綠色熒光蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。隨后,研究audenps/hbmp-2pdna復(fù)合物在干細(xì)胞中的基因表達(dá)量、堿性磷酸酶活性、骨鈣素分泌量和鈣離子分泌量,并進(jìn)行馮庫(kù)薩染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率很大程度上取決于樹(shù)狀大分子表面和內(nèi)部的修飾和改性。rgd多肽的修飾為載體提供了良好的細(xì)胞靶向特異性,而aunps為樹(shù)狀大分子提供了剛性立體三維結(jié)構(gòu),有利于載體對(duì)pdna進(jìn)行壓縮,提高載體的基因轉(zhuǎn)染效率。這證明了本章合成的audenps是一種高效特異性的載體,可負(fù)載hbmp-2pdna成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞。2)基于第二章的研究,第三章選擇基因轉(zhuǎn)染效率最高的兩種audenps作為載體,負(fù)載治療性的sirnas(vegf(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)sirna和bcl-2(b細(xì)胞淋巴瘤-2)sirna),研究audenps在u87mg細(xì)胞(人惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞)中的基因轉(zhuǎn)染效率,評(píng)價(jià)其對(duì)特異基因的沉默能力。研究表明,audenps/sirna復(fù)合物的水合粒徑和表面電勢(shì)分別約為200nm和20mv,這使得復(fù)合物更容易跨越細(xì)胞膜。在不同的樹(shù)狀大分子濃度(0~3000nm)和不同的n/p比(2.5~15)條件下,細(xì)胞存活率呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和n/p比依賴性。即使在最高的濃度和n/p比條件下,細(xì)胞的存活率仍高達(dá)70%以上,證明材料具有良好的細(xì)胞相容性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),audenps/sirna復(fù)合物在n/p比為10的時(shí)候,具有最高的熒光強(qiáng)度,且靶向材料的基因轉(zhuǎn)染效率顯著高于非靶向材料。體外和體內(nèi)的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí),在n/p比等于10的時(shí)候,audenps/sirna復(fù)合物能成功誘導(dǎo)特異性基因沉默,而rgd靶向的audenps基因沉默率高達(dá)70%以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,制備的audenps可作為安全高效的基因治療載體,負(fù)載治療性的sirna應(yīng)用于腫瘤的基因治療。3)第二、三章的研究證明功能化樹(shù)狀大分子是一種安全高效的基因傳遞載體。但前期的工作表明,僅僅單一的基因治療并不能保證完全的殺死癌細(xì)胞,只在一定程度上抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,第四章考慮結(jié)合光熱治療來(lái)實(shí)現(xiàn)理想的腫瘤治療效果。mos2作為一種新型的過(guò)渡金屬二硫化物無(wú)機(jī)材料,具有高的比表面積、強(qiáng)表面吸附特性、高的光熱轉(zhuǎn)換效率以及良好的生物相容性,這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使其有潛力作為一種安全高效的新型光熱劑。本章通過(guò)簡(jiǎn)單的水熱法合成了類似納米片結(jié)構(gòu)的mos2,隨后將表面部分修飾硫辛酸(la)的第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子(g5-la)通過(guò)二硫鍵修飾到mos2表面,合成了第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子修飾的二硫化鉬(g5-mos2)。制備的g5-mos2具有良好的膠體穩(wěn)定性、光熱穩(wěn)定性和生物相容性,其光熱轉(zhuǎn)化效率高達(dá)47.8%,對(duì)癌細(xì)胞具有較大的殺傷力。將g5-mos2與bcl-2sirna復(fù)合轉(zhuǎn)染4t1細(xì)胞(小鼠乳腺癌細(xì)胞),具有較高的基因沉默水平,細(xì)胞中47.3%的基因得到了沉默。而體外的光熱和基因治療效果評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,經(jīng)基因和光熱協(xié)同治療的細(xì)胞存活率僅為21.02%,顯著低于單獨(dú)的光熱治療(45.8%)和基因治療(68.7%)。體內(nèi)的光熱和基因協(xié)同治療效果亦顯示,雙重治療后,腫瘤幾乎被完全消滅,大大地提高了小鼠的存活率。這些結(jié)果說(shuō)明,制備的g5-mos2納米片是一種具有良好生物相容性和血液相容性的納米材料,能成功實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的基因和光熱協(xié)同治療。4)考慮到樹(shù)狀大分子高昂的成本,不利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品最終的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),第五章嘗試?yán)镁垡蚁﹣啺纷鳛檩d體,對(duì)其進(jìn)行功能化修飾。首先在pei表面共價(jià)修飾peg以及靶向分子rgd。再以之為模板,通過(guò)快速還原的方法,按照au/pei=25的投料摩爾比,合成了最終的aupenps。制備的aupenps內(nèi)部的金核粒徑為2.5~2.9nm,呈分布均勻的球形或半球形,具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性。auPENPs負(fù)載siRNA后,在N/P比為10的時(shí)候具有最高的基因轉(zhuǎn)染效率。體內(nèi)和體外的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證明,Au PENPs/siRNA復(fù)合物能抑制特定蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異性的基因沉默。研究表明,合成的Au PENPs能有效的壓縮siRNA,并將siRNA靶向傳遞到αvβ3整合素過(guò)量表達(dá)的癌細(xì)胞中,誘導(dǎo)特異性的基因沉默,降低靶蛋白表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TB383.1;R450

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