本文關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A納米抗體的免疫學(xué)檢測(cè)性能及分子作用機(jī)理研究

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【摘要】：赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一種由青霉素屬和曲霉屬的某些菌種產(chǎn)生的真菌毒素,主要污染谷物及其制品,具有神經(jīng)毒性、肝腎毒性等多種毒性作用。建立谷物中OTA污染殘留的有效監(jiān)控和檢測(cè)方法是防止其造成食品安全問題的重要手段。目前,OTA的檢測(cè)方法主要包括高校液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、免疫學(xué)分析法等,其中免疫學(xué)分析法具有快速、靈敏等特點(diǎn),適合大批量樣本的篩查。納米抗體(Nanobody,Nb)是目前已知的最小抗原結(jié)合單位,源自駝源動(dòng)物體內(nèi)重鏈抗體的重鏈可變區(qū),具有易表達(dá)、水溶性好、穩(wěn)定性高等性質(zhì),目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、疾病治療、食品安全分析等領(lǐng)域。本研究制備了抗OTA Nb,并對(duì)其檢測(cè)性能和作用機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:1、OTA Nb噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建、淘選及應(yīng)用1.1成功構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容為2×107 cfu且多樣性良好的OTA Nb初始文庫(kù),經(jīng)輔助噬菌體救援后獲得滴度為4×1012 cfu/m L的抗OTA Nb噬菌體展示文庫(kù),結(jié)合Gly-HCl洗脫和標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)洗脫兩種方式,進(jìn)行四輪親和淘選,經(jīng)鑒定及DNA測(cè)序分析,共獲得4種獨(dú)特的Nb序列。1.2建立了基于噬菌體VHH-28超靈敏檢測(cè)谷物中OTA的噬菌體RT-IPCR,LOD為3.7 fg/m L,線性范圍0.01-1000 pg/m L,與OTB的交叉反應(yīng)率為3.5%,OTA加標(biāo)回收率80-126%,實(shí)際谷物樣本的RT-IPCR檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)OTA ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。2、OTA Nb的原核表達(dá)、活性分析及應(yīng)用2.1成功制備了四種OTA納米抗體Nb15、28、32、36,間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得IC50分別為160.34、0.64、17.60、286.15 ng/m L。四種Nb的熱穩(wěn)定性良好,95℃加熱5 min和90℃加熱60 min后保留了至少50%和25%的抗原結(jié)合能力。采用Bio-layer interferometry生物傳感器測(cè)定了Nb的平衡解離常數(shù),同時(shí)采用同源建模和分子對(duì)接技術(shù)研究了Nb與OTA的相互作用機(jī)理,結(jié)果表明Nb與OTA之間的相互作用力主要包括氫鍵和疏水作用,且親和力與靈敏度呈正相關(guān)性。2.2建立了基于Nb28檢測(cè)谷物中OTA的Nb-ELISA,IC50 0.64 ng/m L,線性范圍0.27-1.47 ng/m L,LOD 0.16 ng/m L,與OTB的交叉反應(yīng)率為10.4%,批內(nèi)加標(biāo)回收率81-108%,批內(nèi)變異系數(shù)1-9%,批間加標(biāo)回收率為85-99%,批間變異系數(shù)為5-6%。實(shí)際谷物樣本的Nb-ELISA檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)OTA ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。3、OTA Nb-AP融合蛋白的原核表達(dá)、活性分析及應(yīng)用成功構(gòu)制備了Nb28-AP融合蛋白,該融合蛋白仍保留良好的抗原結(jié)合能力和堿性磷酸酶活性。以Nb28-AP融合蛋白為檢測(cè)探針,建立了檢測(cè)谷物中OTA的dc-FEIA,IC50 0.13 ng/m L,線性范圍0.06-0.43 ng/m L,LOD 0.04 ng/m L。與其它常見真菌毒素未見交叉反應(yīng),批內(nèi)加標(biāo)回收率72-121%,批內(nèi)變異系數(shù)分別為2-13%,批間加標(biāo)回收率73-109%,批間變異系數(shù)5-9%。實(shí)際谷物樣本的檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS207.3
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本文編號(hào)：1169120