本文關(guān)鍵詞：L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化

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【摘要】：L-異亮氨酸是八種必需氨基酸之一,在人體代謝中具有重要作用。在L-異亮氨酸的合成過程中,乙酰羥基酸合成酶催化丙酮酸和前體α-酮基丁酸生成L-異亮氨酸。由于乙酰羥基酸合成酶對α-酮基丁酸親和性高于丙酮酸,當(dāng)胞內(nèi)α-酮基丁酸供應(yīng)量增加時(shí),乙酰羥基酸合成酶可優(yōu)先催化生成L-異亮氨酸。同時(shí)乙酰羥基酸合成酶是L-異亮氨酸合成途徑的限速酶,強(qiáng)化該酶可以加速限速反應(yīng),有利于L-異亮氨酸積累。為了研究增加胞內(nèi)α-酮基丁酸的供應(yīng)和強(qiáng)化乙酰羥基酸合成酶對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響,本文以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW為出發(fā)菌株進(jìn)行改造,通過質(zhì)粒過表達(dá)cimA成功構(gòu)建了C. glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出發(fā)菌株基因組ilvB上游插入Ptac強(qiáng)啟動子成功構(gòu)建C. glutamicum YILWPtac;在C. glutamicum YILWPtac基礎(chǔ)上質(zhì)粒過表達(dá)cimA,獲得C. glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通過RT-PCR分析,cimA和ilvB的轉(zhuǎn)錄量分別提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C. glutamicum YILWpXMJ 19cimA可以表達(dá)。對出發(fā)菌株和改造菌進(jìn)行搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵比較改造菌產(chǎn)酸水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與出發(fā)菌C. glutamicum YILW相比,YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-異亮氨酸積累量提高了8.9%和14.8%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了17.8%和18.6%,單位菌體產(chǎn)酸提高了15.1%和20.3%,副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸較原菌分別降低了25.0%和29.9%。Cglutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-異亮氨酸積累量較原菌提高了14.5%,副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸較原菌降低了8.6%,糖酸轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)酸分別提高了42.4%和17.6%,糖酸轉(zhuǎn)化率較YILWpXMJ 19cimA和YILWPtac分別提高了20.8%和20.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過Ptac強(qiáng)啟動子插入?yún)f(xié)同cimA表達(dá)增加胞內(nèi)α-酮丁酸的供應(yīng)和強(qiáng)化限速酶乙酰羥基酸合成酶的方法可以提高產(chǎn)酸,并能夠較明顯的提高菌體的糖酸轉(zhuǎn)化率。代謝分析表明L-異亮氨酸合成代謝流從1.09%分別提高到2.33%、7.69%和4.26%。5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)菌體在20 h過早地進(jìn)入穩(wěn)定期,并表現(xiàn)出生長停滯,耗糖耗氧變慢的情況。針對該現(xiàn)象在發(fā)酵過程中依次流加了豆餅水解液、玉米漿、生物素、氨基酸復(fù)合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)。結(jié)果菌體生物量低的問題依然沒有解決。通過流加實(shí)驗(yàn)排除了流加的成分是菌體生長的限制因素,猜測可能是玉米漿中的某種或某幾種未知的營養(yǎng)因子限制菌體生長和產(chǎn)酸。
【關(guān)鍵詞】：L-異亮氨酸 α-酮基丁酸 強(qiáng)啟動子 流加
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ922
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 1 前言10-26
• 1.1 引言10
• 1.2 L-異亮氨酸的理化性質(zhì)及應(yīng)用10-12
• 1.2.1 L-異亮氨酸的理化性質(zhì)10-11
• 1.2.2 L-異亮氨酸的應(yīng)用11-12
• 1.3 L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法及生產(chǎn)概況12-13
• 1.3.1 L-異亮氨酸生產(chǎn)方法12-13
• 1.3.2 L-異亮氨酸生產(chǎn)概況13
• 1.4 L-異亮氨酸的生物合成途徑及調(diào)節(jié)機(jī)制13-17
• 1.4.1 L-異亮氨酸生物合成途徑13-14
• 1.4.2 L-異亮氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制14-17
• 1.5 L-異亮氨酸生產(chǎn)菌的常規(guī)育種思路及育種實(shí)例17-20
• 1.5.1 常規(guī)育種思路17-19
• 1.5.2 常規(guī)誘變育種實(shí)例19-20
• 1.6 代謝工程理論在構(gòu)建L-異亮氨酸生產(chǎn)菌中的應(yīng)用20-22
• 1.6.1 基于代謝工程理論的L-異亮氨酸工程菌的構(gòu)建思路20
• 1.6.2 分子研究進(jìn)展20-22
• 1.7 基于α-酮基丁酸節(jié)點(diǎn)處的代謝流研究22
• 1.8 利用發(fā)酵優(yōu)化提高L-異亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)22-23
• 1.9 論文的立題背景和研究內(nèi)容23-26
• 1.9.1 立題背景23-24
• 1.9.2 本論文的主要研究內(nèi)容24-26
• 2 材料與方法26-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 2.1.1 菌株26
• 2.2 主要儀器和試劑26-32
• 2.2.1 主要儀器27
• 2.2.2 主要試劑27-29
• 2.2.3 主要溶液29-32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法32-44
• 2.3.1 質(zhì)粒提取32
• 2.3.2 基因組小量提取32-33
• 2.3.3 DNA限制性內(nèi)切酶酶切33
• 2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳33-34
• 2.3.5 DNA的回收純化34
• 2.3.6 連接與化轉(zhuǎn)34-35
• 2.3.7 感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化35-36
• 2.3.8 PCR擴(kuò)增36-37
• 2.3.9 轉(zhuǎn)化子鑒定37
• 2.3.10 目的基因測序轉(zhuǎn)化子鑒定37
• 2.3.11 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳37-38
• 2.3.12 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)38-39
• 2.3.13 谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-異亮氨酸的培養(yǎng)條件及測定方法39-40
• 2.3.14 高效液相色譜法定量檢測發(fā)酵液中的氨基酸濃度40-41
• 2.3.15 代謝流量分析41-44
• 3 結(jié)果與討論44-71
• 3.1 谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)載體pXMJ19cimA的構(gòu)建44-45
• 3.1.1 cimA基因的擴(kuò)增44
• 3.1.2 表達(dá)載體pXMJ19cimA的構(gòu)建44-45
• 3.2 C.glutamicum YILWpXMJ19cimA的構(gòu)建45
• 3.3 谷氨酸棒狀桿菌整合載體pK18mobsacBPtac的構(gòu)建45-48
• 3.3.1 tac的擴(kuò)增45-46
• 3.3.2 插入tac序列的同源序列構(gòu)建46-47
• 3.3.3 谷氨酸棒狀桿菌整合載體pK18mobsacBPtac的構(gòu)建47-48
• 3.4 C.glutamicum YILWPtac的構(gòu)建48-51
• 3.4.1 整合載體pK18mobsacBPtac電轉(zhuǎn)整合C glutamicum YILW48-49
• 3.4.2 C.glutamicum YILWPtac的篩選49-51
• 3.5 C.glutamicum YILWPtacpXMJl9cimA的構(gòu)建51
• 3.6 cimA編碼蛋白的表達(dá)和Ptac強(qiáng)啟動子的影響51-54
• 3.6.1 cimA編碼的異源蛋白在C.glutamicum YILWpXMJl9cimA中表達(dá)51-53
• 3.6.2 Ptac強(qiáng)啟動子對C.glutamicum YILWPtac中ilvB轉(zhuǎn)錄的影響53-54
• 3.7 L-異亮氨酸分批發(fā)酵研究54-57
• 3.7.1 cimA異源表達(dá)對C.glutamicum YILWpXMJ19cimA發(fā)酵的影響54-56
• 3.7.2 啟動子Ptac插入對C.glutamicum YILWPtac發(fā)酵的影響56
• 3.7.3 啟動子Ptac插入?yún)f(xié)同cimA表達(dá)對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響56
• 3.7.4 cimA表達(dá)與啟動子Ptac插入對L-異亮氨酸發(fā)酵中副產(chǎn)物的影響56-57
• 3.8 cimA表達(dá)協(xié)同啟動子Ptac插入對L-異亮氨酸發(fā)酵影響的討論57-58
• 3.9 5L發(fā)酵罐分批發(fā)酵研究58-60
• 3.10 代謝流分布比較60-62
• 3.11 分批發(fā)酵優(yōu)化62-70
• 3.11.1 碳源的優(yōu)化63
• 3.11.2 氮源的優(yōu)化63-69
• 3.11.3 其它營養(yǎng)要素的優(yōu)化69
• 3.11.4 綜合多營養(yǎng)策略優(yōu)化69-70
• 3.12 發(fā)酵優(yōu)化小結(jié)70-71
• 4 結(jié)論71-72
• 5 展望72-73
• 6 參考文獻(xiàn)73-79
• 7 研究生期間發(fā)表論文情況79-80
• 8 致謝80

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本文編號：830920