本文關(guān)鍵詞：DnaK蛋白質(zhì)的純化及其生物化學(xué)性質(zhì)分析

  更多相關(guān)文章： Hsp70s DnaK 二聚體 熒光偏振 色氨酸熒光分析

【摘要】：熱休克蛋白70s(Heat shock proteins, Hsp70s)是從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中均廣泛存在的一類(lèi)保守的蛋白質(zhì)家族,是維持蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的分子伴侶。DnaK,作為大腸桿菌中的重要的Hsp70蛋白質(zhì),常被當(dāng)作研究Hsp70s的模型。通過(guò)分析DnaK-ATP復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu),可知其呈現(xiàn)二聚體狀態(tài),且兩個(gè)相同的單體通過(guò)氫鍵作用力形成典型的相互作用空間,在該空間內(nèi)單體的表面結(jié)構(gòu)高度互補(bǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中,首先依據(jù)DnaK-ATP的空間結(jié)構(gòu),通過(guò)蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)證明了DnaK在A(yíng)TP存在時(shí)確實(shí)能夠形成特殊的二聚體。為了進(jìn)一步理解此二聚體的生理意義,在二聚體的相互作用面上選擇了5個(gè)重要氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)突變。體內(nèi)生長(zhǎng)測(cè)試結(jié)果顯示四個(gè)突變R56A、T301A、N537A、D540A均可導(dǎo)致分子伴侶活性的降低,這也就暗示了DnaK二聚體的重要性。利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)上述突變蛋白質(zhì),并采用硫酸鎳親和層析以及陰離子交換層析對(duì)其進(jìn)行純化。通過(guò)熒光偏振技術(shù)檢測(cè)突變蛋白質(zhì)與多肽底物的結(jié)合能力并與野生型DnaK蛋白質(zhì)進(jìn)行比較,利用PRISM軟件分析其分離常數(shù)(Kd),結(jié)果顯示這些突變體并不影響DnaK原有的與多肽的結(jié)合能力。進(jìn)一步利用色氨酸特殊的熒光特性分析這些突變體是否影響ATP導(dǎo)致的DnaK變構(gòu)耦合,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,所有突變體與野生型并無(wú)明顯差別,均產(chǎn)生6 nm左右的藍(lán)移,也就是說(shuō)上述二聚體突變并不能影響ATP導(dǎo)致的變構(gòu)耦合。綜上所述,DnaK在含有ATP的環(huán)境中確實(shí)能夠形成二聚體,此二聚體結(jié)構(gòu)對(duì)分子伴侶功能的發(fā)揮意義重大。破壞二聚體空間結(jié)構(gòu)會(huì)極大地影響其分子伴侶活性,但并不影響DnaK原有的與底物的結(jié)合能力,也不能夠影響ATP導(dǎo)致的變構(gòu)耦合。
【關(guān)鍵詞】：Hsp70s DnaK 二聚體 熒光偏振 色氨酸熒光分析
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：O629.73
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-20
• 1.1 Hsp的研究概況8-10
• 1.1.1 Hsp的發(fā)現(xiàn)8-9
• 1.1.2 Hsp的分類(lèi)9
• 1.1.3 Hsp應(yīng)用研究的意義9-10
• 1.2 Hsp70的研究概況10-14
• 1.2.1 Hsp70的分類(lèi)10
• 1.2.2 Hsp70的結(jié)構(gòu)特征10-11
• 1.2.3 Hsp70的生物學(xué)功能11-13
• 1.2.4 Hsp70在食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用13-14
• 1.3 DnaK的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.3.1 DnaK水解ATP反應(yīng)14-15
• 1.4 蛋白質(zhì)誘導(dǎo)純化技術(shù)15-17
• 1.4.1 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白原理15-16
• 1.4.2 蛋白質(zhì)表達(dá)純化方法16-17
• 1.5 本課題研究的目的、意義及主要內(nèi)容17-20
• 1.5.1 研究目的及意義17-18
• 1.5.2 本課題研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線(xiàn)18-20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑20-22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-34
• 2.2.1 DnaK定點(diǎn)突變DNA的制備23-26
• 2.2.2 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)26-28
• 2.2.3 蛋白質(zhì)的純化28-31
• 2.2.4 蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)31
• 2.2.5 體內(nèi)生長(zhǎng)測(cè)試31-32
• 2.2.6 蛋白質(zhì)與多肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)32
• 2.2.7 色氨酸熒光分析32-34
• 3 結(jié)果與討論34-49
• 3.1 定點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建34-36
• 3.2 蛋白質(zhì)高效表達(dá)及純化結(jié)果36-42
• 3.2.1 DnaK-WT蛋白質(zhì)的高效表達(dá)36-37
• 3.2.2 Ni親和層析柱純化DnaK-WT37-40
• 3.2.3 陰離子交換柱純化DnaK-WT40-41
• 3.2.4 DnaK突變體的純化41-42
• 3.3 DnaK在A(yíng)TP存在的情況下能夠形成特殊的二聚體42-44
• 3.4 DnaK二聚體對(duì)機(jī)體正常生長(zhǎng)具有重要作用44-45
• 3.5 DnaK二聚體突變體對(duì)多肽的結(jié)合無(wú)明顯影響45-47
• 3.6 突變體對(duì)ATP導(dǎo)致的變構(gòu)耦合無(wú)影響47-49
• 4 結(jié)論49-50
• 5 展望50-51
• 6 參考文獻(xiàn)51-58
• 7 碩士期間發(fā)表論文情況58-59
• 8 致謝59-60
• 9 附錄60

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