本文關鍵詞：pH及糖基化處理對菲律賓蛤仔原肌球蛋白性質的影響

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【摘要】：菲律賓蛤仔屬于我國四大養(yǎng)殖貝類之一,不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富,還具有很高的經(jīng)濟價值�！俺愿蝌�,喝啤酒”也是青島帶給世界各地游客的獨有體驗。作為人類常見的食物過敏原之一,由菲律賓蛤仔引發(fā)的過敏性疾病發(fā)病率也日益增高。本論文以菲律賓蛤仔主要過敏原——原肌球蛋白為研究對象,系統(tǒng)分析了其理化性質,探究了pH變化及糖基化對原肌球蛋白過敏原性的影響,并采用生物信息學軟件對其抗原表位進行初步分析,為認識菲律賓蛤仔過敏及消減其過敏原性提供基礎數(shù)據(jù)。主要研究結果包括：1、分離并純化了菲律賓蛤仔的主要過敏原——原肌球蛋白,并利用免疫學技術進行了鑒定。進一步對其理化性質進行表征發(fā)現(xiàn),菲律賓蛤仔原肌球蛋白的分子量在37 kDa左右,等電點為5.1;糖含量為6.34%；對熱比較穩(wěn)定,經(jīng)過沸水煮15 min,其IgG結合能力沒有明顯的變化。此外,采用RACE技術對表達原肌球蛋白的基因序列進行表征,發(fā)現(xiàn)其全長為855 bp,編碼284個氨基酸。2、不同pH處理能夠部分改變菲律賓蛤仔原肌球蛋白的過敏原性。在不同的pH環(huán)境條件下,采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗、點印記、蛋白酶酶解實驗、圓二色譜、表面疏水性及紫外光譜等系統(tǒng)解析了原肌球蛋白分子結構與過敏原性的變化。結果表明,pH從7.0下降至1.0,原肌球蛋白的結構趨于松散,表面疏水性降低了97.7%,免疫活性降低；在pH9.0的堿性條件下,原肌球蛋白的過敏性有所增高。這說明采用低pH處理能夠部分降低菲律賓蛤仔的過敏原性。3、核糖引發(fā)的美拉德反應能夠有效降低菲律賓蛤仔原肌球蛋白的過敏原性。在核糖的作用下,原肌球蛋白發(fā)生美拉德反應,采用酶聯(lián)免疫、點印記、圓二色譜、賴氨酸含量等對核糖與原肌球蛋白的美拉德反應產(chǎn)物進行解析,結果表明,在核糖作用12h后,原肌球蛋白的二級結構發(fā)生的明顯的變化,α-螺旋含量下降了71.7%,蛋白表面疏水性增加了192%,有效賴氨酸含量降低了45.5%,過敏原性變化分析顯示,美拉德反應產(chǎn)物的IgE結合能力下降76.2%,IgG結合能力下降86.8%。由此表明,核糖能夠有效降低菲律賓蛤仔原肌球蛋白的過敏原性。。4、利用生物信息軟件對菲律賓蛤仔原肌球蛋白的抗原表位進行預測分析。結果表明,原肌球蛋白的氨基酸序列較為保守,不同種類軟體動物的序列之間同源性達到75%以上,有的可以達到90%以上。采用DNAstar、AntheProt生物信息學軟件并結合2個在線網(wǎng)站對原肌球蛋白的線性表位區(qū)域進行預測,得到10個抗原表位。這些表位在整個序列中的分布較為平均,有7個肽段的位置與已經(jīng)報道的表位區(qū)域存在部分重合的現(xiàn)象,再根據(jù)之前的實驗結果篩選可能性最高的四個表位進行Fmoc固相合成,采用競爭點印記方法,利用兔抗蛤蜊血清和過敏患者血清對其活性進行初步驗證。4個多肽均為主要過敏原表位。綜上所述,本研究對菲律賓蛤仔主要過敏原一一原肌球蛋白的理化性質進行解析,闡明了pH處理及糖基化處理對原肌球蛋白過敏原性的影響,并進一步利用生物信息學技術分析了原肌球蛋白的抗原表位。該研究結果對于認清菲律賓蛤仔過敏原的基本性質,開發(fā)低過敏性或無過敏性貝類食品,保障消費者食用安全等具有積極的意義。
【關鍵詞】：過敏原 菲律賓蛤仔 原肌球蛋白 pH 糖基化 IgE結合活性
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS254.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-24
• 0.1 食物過敏原研究進展14-15
• 0.2 軟體類過敏原概述15-17
• 0.2.1 軟體類過敏原種類15-17
• 0.2.2 菲律賓蛤仔相關研究17
• 0.3 過敏原抗原性消減方法17-20
• 0.3.1 物理法18-19
• 0.3.2 化學法19
• 0.3.3 生物法19-20
• 0.4 表位研究概述20-22
• 0.5 研究目的和意義22-23
• 0.6 本論文的技術路線23-24
• 1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白性質分析24-39
• 1.1 引言24
• 1.2 實驗材料24-28
• 1.2.1 主要試劑及生物材料24-25
• 1.2.2 實驗儀器設備25-26
• 1.2.3 溶液配制步驟26-28
• 1.3 主要方法28-30
• 1.3.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白純化制備28-29
• 1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)29
• 1.3.3 免疫印跡29
• 1.3.4 點印記29
• 1.3.5 雙向電泳29-30
• 1.3.6 蛋白糖含量測定30
• 1.3.7 熱穩(wěn)定性30
• 1.3.8 差示掃描量熱法測定蛋白的熱性能30
• 1.3.9 蛋白克隆及測序30
• 1.4 結果與討論30-37
• 1.4.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白的純化鑒定30-32
• 1.4.2 菲律賓蛤仔原肌球蛋白等電點測定32-33
• 1.4.3 菲律賓蛤仔原肌球蛋白糖含量測定33
• 1.4.4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白熱穩(wěn)定性33-34
• 1.4.5 菲律賓蛤仔原肌球蛋白熱性能34
• 1.4.6 菲律賓蛤仔原肌球蛋白克隆及測序34-37
• 1.5 本章小結37-39
• 2 不同pH條件下菲律賓蛤仔原肌球蛋白免疫活性變化39-53
• 2.1 引言39
• 2.2 實驗材料39-41
• 2.2.1 主要試劑及生物材料39-40
• 2.2.2 實驗儀器設備40
• 2.2.3 溶液配制步驟40-41
• 2.3 主要方法41-44
• 2.3.1 SDS-PAGE41
• 2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗41-42
• 2.3.3 點印記42
• 2.3.4 胃蛋白酶消化實驗42-43
• 2.3.5 圓二色譜測定43
• 2.3.6 蛋白表面疏水性測定43
• 2.3.7 紫外全波長掃描43
• 2.3.8 數(shù)據(jù)分析43-44
• 2.4 結果與討論44-52
• 2.4.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白在不同pH條件下蛋白組分變化44-45
• 2.4.2 菲律賓蛤仔原肌球蛋白在不同pH條件下IgG/IgE結合能力變化45-47
• 2.4.3 菲律賓蛤仔原肌球蛋白抗酶解能力變化47-49
• 2.4.4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白圓二色譜掃描結果49-50
• 2.4.5 菲律賓蛤仔原肌球蛋白在不同pH條件下疏水性變化50-51
• 2.4.6 菲律賓蛤仔原肌球蛋白在不同pH條件下紫外吸收光譜變化51-52
• 2.5 本章小結52-53
• 3 糖基化對菲律賓蛤仔原肌球蛋白免疫活性影響53-63
• 3.1 引言53
• 3.2 實驗原料53-54
• 3.2.1 主要試劑及生物材料53-54
• 3.2.2 實驗儀器設備54
• 3.2.3 溶液配制步驟54
• 3.3 主要方法54-55
• 3.3.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白的糖基化改性54
• 3.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳54
• 3.3.3 圓二色譜54
• 3.3.4 蛋白表明疏水性測定54-55
• 3.3.5 反應產(chǎn)物中有效賴氨酸含量測定55
• 3.3.6 點印記55
• 3.3.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗55
• 3.4 結果與討論55-62
• 3.4.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與核糖羰氨反應后蛋白組分變化55-56
• 3.4.2 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與核糖羰氨反應后二級結構變化56-58
• 3.4.3 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與核糖羰氨反應后疏水性變化58-59
• 3.4.4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與核糖羰氨反應后賴氨酸含量變化59-60
• 3.4.5 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與核糖羰氨反應后IgG/IgE結合能力60-62
• 3.5 本章小結62-63
• 4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白線性表位初步篩選63-76
• 4.1 引言63
• 4.2 主要方法63-65
• 4.2.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與其他5種原肌球蛋白過敏原同源性分析63-64
• 4.2.2 菲律賓蛤仔原肌球蛋白抗原性指數(shù)分析64
• 4.2.3 菲律賓蛤仔原肌球蛋白表位的在線工具預測64
• 4.2.4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白表位的綜合分析預測64-65
• 4.2.5 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與人和豬原肌球蛋白序列對比65
• 4.2.6 預測表位的合成及純度分析65
• 4.2.7 合成表位活性分析65
• 4.3 結果與討論65-75
• 4.3.1 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與其他5種原肌球蛋白過敏原同源性分析65-68
• 4.3.2 菲律賓蛤仔原肌球蛋白抗原性指數(shù)分析68
• 4.3.3 菲律賓蛤仔原肌球蛋白表位的在線工具預測68-69
• 4.3.4 菲律賓蛤仔原肌球蛋白表位的綜合分析預測69-72
• 4.3.5 菲律賓蛤仔原肌球蛋白與人和豬原肌球蛋白序列對比72-73
• 4.3.6 預測表位的合成及純度分析73-74
• 4.3.7 合成表位活性分析74-75
• 4.4 本章小結75-76
• 5 論文總結76-78
• 6 論文的創(chuàng)新與展望78-79
• 參考文獻79-88
• 致謝88-89
• 個人簡歷89
• 發(fā)表的學術論文89

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