本文關(guān)鍵詞：深海中產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析

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【摘要】：蛋白酶是工業(yè)上主要用酶之一,廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。其中,冷適蛋白酶在食品加工和化妝品應(yīng)用方面有中溫蛋白酶無法取代的優(yōu)勢,其最顯著的三大特點為最適溫度一般在10℃-45℃、0-30℃范圍內(nèi)催化效率較高、熱穩(wěn)定性比中溫酶差。本論文從深海沉積物中篩選到一株產(chǎn)蛋白酶菌株,并對其進(jìn)行菌種鑒定、培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶液的酶學(xué)性質(zhì)分析,為冷適酶的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。結(jié)果如下：通過對菌株的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)分析,確定該菌株為革蘭氏陽性菌株,能夠利用多種糖源發(fā)酵,接觸酶試驗和甲基紅試驗為陰性,硝酸鹽,精氨酸雙水解酶試驗和VP試驗為陽性。進(jìn)一步對該菌株的16S rDNA序列比對,發(fā)現(xiàn)其與Bacillus subtilis strain Acj 115有較近的親緣關(guān)系,確定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),命名為Bacillus subtilis.N-9。采用單因素試驗和正交試驗,在搖瓶水平上對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為(g/L)：木糖25,蛋白胨35,酵母浸出物16,NaC110, KH2PO43, K2HPO47;優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：pH 5.5,裝液量80 mL,種齡15 h,接種量3.5%,在以上優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵,測定蛋白酶酶活為306.93 U/mL,較優(yōu)化之前提高了223.56%。采用硫酸銨分級沉淀對菌株發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶液進(jìn)行初步純化,分析該蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)。作為一種冷適酶,該蛋白酶的最適溫度為40℃；具有較高低溫催化活性,0℃時蛋白酶活仍有7.05%的催化能力；也具有典型的冷適酶的熱不穩(wěn)定性,在60℃下保溫15 min蛋白酶活力僅剩39%。該蛋白酶的最適pH為7.0,在pH為6.0-8.0范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性；金屬離子對蛋白酶活力影響不明顯；PMSF則強烈抑制酶活力,表明該蛋白酶為絲氨酸蛋白酶；表面活性劑SDS較Tween-80對蛋白酶活力的影響更為明顯；該酶對有機溶劑甲醇、乙醇和甘油呈現(xiàn)良好的耐受性。
【關(guān)鍵詞】：冷適蛋白酶 枯草芽孢桿菌 參數(shù)優(yōu)化 酶學(xué)性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ925.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-21
• 1.1 海洋環(huán)境9
• 1.2 海洋微生物分類9-11
• 1.2.1 海洋細(xì)菌10-11
• 1.2.2 海洋細(xì)菌多樣性研究及意義11
• 1.3 低溫微生物11-14
• 1.3.1 低溫微生物的分布11-12
• 1.3.2 低溫微生物的適冷機制12-14
• 1.4 冷適酶及適冷機制14-15
• 1.4.1 冷適酶14-15
• 1.4.2 冷適酶的適冷機制15
• 1.5 蛋白酶分類及作用特點15-17
• 1.5.1 金屬蛋白酶16
• 1.5.2 絲氨酸蛋白酶16
• 1.5.3 天冬氨酸蛋白酶16
• 1.5.4 半胱氨酸蛋白酶16-17
• 1.6 冷適酶的應(yīng)用17-20
• 1.6.1 冷適蛋白酶的研究現(xiàn)狀17-18
• 1.6.2 冷適蛋白酶研究方面的不足18-19
• 1.6.3 冷適蛋白酶的應(yīng)用19-20
• 1.7 本課題立題背景和意義20-21
• 2 材料和方法21-36
• 2.1 實驗材料21-27
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒21
• 2.1.2 工具酶及相關(guān)試劑21-23
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備23-24
• 2.1.4 培養(yǎng)基和主要溶液24-27
• 2.1.5 實驗所用引物27
• 2.2 實驗方法27-36
• 2.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選27-28
• 2.2.2 菌株鑒定28-32
• 2.2.3 發(fā)酵時間對菌株生長及產(chǎn)酶的影響32
• 2.2.4 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化32-33
• 2.2.5 菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化33-34
• 2.2.6 菌株酶學(xué)性質(zhì)的研究34-36
• 3 結(jié)果與討論36-49
• 3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選36-37
• 3.1.1 蛋白酶生產(chǎn)菌株的初篩36
• 3.1.2 蛋白酶生產(chǎn)菌株的復(fù)篩36-37
• 3.2 菌株鑒定37-40
• 3.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察37
• 3.2.2 生理生化特性37-38
• 3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析38-39
• 3.2.4 鑒定結(jié)果39-40
• 3.3 培養(yǎng)時間對菌株生長及產(chǎn)酶的影響40
• 3.4 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化40-45
• 3.4.1 碳源試驗40-41
• 3.4.2 氮源試驗41-43
• 3.4.3 不同濃度NaCl對蛋白酶活的影響43-44
• 3.4.4 正交試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基44-45
• 3.5 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化45-49
• 3.5.1 pH對蛋白酶活的影響45-46
• 3.5.2 接種量對蛋白酶活的影響46-47
• 3.5.3 種齡對蛋白酶活性的影響47
• 3.5.4 裝液量對蛋白酶活性的影響47-48
• 3.5.5 正交試驗確定最佳發(fā)酵條件48-49
• 4 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)49-56
• 4.1 (NH_4)_2SO_4分級沉淀條件的確定49
• 4.2 蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的分析49-56
• 4.2.1 酶的最適pH49-50
• 4.2.2 酶的pH穩(wěn)定性50
• 4.2.3 酶的最適溫度50-51
• 4.2.4 酶的熱穩(wěn)定性51-52
• 4.2.5 金屬離子對蛋白酶酶活力的影響52-53
• 4.2.6 不同抑制劑對蛋白酶活力的影響53-54
• 4.2.7 表面活性劑對蛋白酶活性的影響54-55
• 4.2.8 有機溶劑對蛋白酶活力的影響55-56
• 5 結(jié)論56-57
• 6 展望57-58
• 7 參考文獻(xiàn)58-65
• 8 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況65-66
• 9 致謝66

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本文編號：644717