本文關(guān)鍵詞：基于適配體熒光傳感器檢測(cè)IgE的方法研究

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【摘要】：免疫球蛋白E(IgE)是一種分泌型免疫球蛋白,在人類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。一般情況下,IgE在人血清中的含量很低,然而在過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性皮炎或其他免疫缺陷病的病人血清內(nèi),IgE含量會(huì)升高。因此,建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏的IgE的檢測(cè)方法對(duì)于過(guò)敏性疾病的臨床診斷至關(guān)重要。本文結(jié)合熒光光譜分析技術(shù)和具有高特異性識(shí)別能力的核酸適配體,建立了一種基于能量共振轉(zhuǎn)移原理的熒光傳感器檢測(cè)IgE的方法。本文以花菁類(lèi)熒光染料——Cy5和水溶性好的碳納米材料——氧化石墨烯(GO)分別作為熒光能量的供體和受體。當(dāng)5’端標(biāo)記有Cy5的IgE的適配體核酸鏈和GO同時(shí)存在時(shí),它們之間產(chǎn)生π-π共軛堆積作用,而被穩(wěn)定地吸附在GO的表面,Cy5與GO靠近,發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,Cy5的熒光被猝滅。當(dāng)IgE存在時(shí),核酸適配體與其特異性結(jié)合形成蛋白質(zhì)-適配體復(fù)合物,GO對(duì)復(fù)合物吸附能力減弱,復(fù)合物脫離GO的表面,Cy5的熒光信號(hào)得到恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)首先采用三維熒光光譜(3D-EMM)分析法對(duì)Cy5標(biāo)記適配體后的熒光性質(zhì)進(jìn)行了分析,確定了633 nm為激發(fā)波長(zhǎng)(Ex),675 nm為發(fā)射波長(zhǎng)(Em)。然后,根據(jù)熒光猝滅性能對(duì)氧化石墨烯(GO)等四種碳納米材料進(jìn)行了選擇,優(yōu)化了檢測(cè)體系的pH值和離子強(qiáng)度(Mg2+濃度),考察了適配體和IgE的孵育溫度和時(shí)間。結(jié)果表明,GO為最佳猝滅劑,檢測(cè)體系pH值為7.4,Mg2+濃度為1 mmol/L,37℃條件下,孵育30 mmin時(shí),熒光信號(hào)恢復(fù)的響應(yīng)值最高。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)不同濃度的IgE溶液進(jìn)行檢測(cè),得到0.05-10 nmol/L的線(xiàn)性范圍,檢出限為0.001nmol/L。與IgE結(jié)構(gòu)相似的IgG(免疫球蛋白G)和血清中大量存在的HSA(人血清白蛋白)在高濃度時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的響應(yīng)值很低,說(shuō)明本方法具有好的選擇性和高的特異性。將本文建立的方法對(duì)血清樣品中IgE含量進(jìn)行檢測(cè),用經(jīng)典的酶聯(lián)免疫法(ELISA)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,兩種方法具有很好的一致性,因此說(shuō)明本文方法高效、快速、靈敏,在實(shí)際臨床應(yīng)用中存在很大的潛力。
【關(guān)鍵詞】：適配體 IgE 熒光傳感 氧化石墨烯 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R446.6;O657.3
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-27
• 1.1 核酸適配體8-16
• 1.1.1 核酸適配體的篩選9
• 1.1.2 核酸適配體的特性9-10
• 1.1.3 核酸適配體與配體目標(biāo)物的作用10-11
• 1.1.4 核酸適配體的應(yīng)用領(lǐng)域11-13
• 1.1.5 適配體傳感器13-16
• 1.2 熒光適配體傳感器16-21
• 1.2.1 熒光傳感器16
• 1.2.2 熒光傳感器的分類(lèi)16-19
• 1.2.3 適配體熒光傳感器19-21
• 1.3 氧化石墨烯21-23
• 1.3.1 氧化石墨烯概述21-22
• 1.3.2 氧化石墨烯在熒光傳感器中的應(yīng)用22-23
• 1.4 免疫球蛋白E23-26
• 1.4.1 免疫球蛋白E的概述23-24
• 1.4.2 免疫球蛋白E檢測(cè)方法24
• 1.4.3 核酸適配體在免疫球蛋白E檢測(cè)方法的應(yīng)用與發(fā)展24-26
• 1.5 本課題研究的主要內(nèi)容26-27
• 2 材料與方法27-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-30
• 2.1.1 化學(xué)試劑27
• 2.1.2 生物試劑27-28
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和材料28
• 2.1.4 待測(cè)樣品28-29
• 2.1.5 主要溶液的配制29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 2.2.1 孵育條件30
• 2.2.2 光譜條件30
• 2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制30-31
• 2.2.4 條件的優(yōu)化31-32
• 2.2.5 樣品前處理32
• 2.2.6 方法驗(yàn)證32-33
• 3 結(jié)果與討論33-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)原理33
• 3.2 最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定33-36
• 3.3 Cy5與FAM的比較36-37
• 3.4 猝滅材料的選擇37-39
• 3.4.1 水體系37-38
• 3.4.2 PBS體系38-39
• 3.5 G0最佳濃度的確定39-40
• 3.6 離子強(qiáng)度的選擇40-42
• 3.7 pH的優(yōu)化42-43
• 3.8 溫度的選擇43-44
• 3.9 孵育時(shí)間44-45
• 3.10 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立45-46
• 3.11 特異性驗(yàn)證46-47
• 3.12 方法驗(yàn)證47-48
• 4 結(jié)論48-49
• 5 展望49-50
• 6 參考文獻(xiàn)50-58
• 7 碩士期間發(fā)表論文情況58-59
• 8 致謝59

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