本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)乳酸的纖維素原料處理—固定化米根霉產(chǎn)果膠酶的研究

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【摘要】：L-乳酸是生物醫(yī)用高分子材料聚乳酸合成的單體。由于聚乳酸具有良好的生物相容性和可降解性,在生物醫(yī)藥和環(huán)保領(lǐng)域都得到廣泛的關(guān)注。隨著聚乳酸研究的迅速發(fā)展,乳酸的生產(chǎn)日益受到重視。米根霉由于具備營(yíng)養(yǎng)需求低,產(chǎn)出的L-乳酸光學(xué)純度高,易于分離等特點(diǎn),成為了目前制備高光學(xué)純度L-乳酸的主要菌種。然而米根霉發(fā)酵L-乳酸的工業(yè)化過(guò)程中底物成本是個(gè)難題。生物質(zhì)資源—天然纖維素(煙梗等)由于成本低廉和來(lái)源豐富,被認(rèn)為是生產(chǎn)乳酸的有效碳源�？墒怯捎诠z將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素緊密的纏繞在一起,造成微生物利用天然纖維素生產(chǎn)乳酸的困難,增加了酶制劑的費(fèi)用,削弱了節(jié)約原料費(fèi)用的優(yōu)勢(shì)。一般生物質(zhì)的非酸預(yù)處理方法對(duì)半纖維素和果膠的處理不夠,而生物酶法和微生物法,能去除生物質(zhì)中的果膠和半纖維素等。微生物(如米根霉等)產(chǎn)生的果膠酶能降解天然纖維素中的果膠,同時(shí)果膠酶被廣泛用于食品、紡織、醫(yī)藥等領(lǐng)域,其市場(chǎng)需求量日益增長(zhǎng)。本文采用有產(chǎn)果膠酶能力且富有商業(yè)價(jià)值的安全菌種—米根霉,使用實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的棉布載體固定化細(xì)胞的技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)果膠酶,以期實(shí)現(xiàn)半連續(xù)化產(chǎn)酶和降解煙梗果膠的目標(biāo),為米根霉利用煙梗生產(chǎn)乳酸做準(zhǔn)備。首先從純果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶出發(fā),研究了固定化發(fā)酵與游離兩種方式,優(yōu)化了純果膠培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,模擬了單批次發(fā)酵菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)行為,還進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn);然后優(yōu)化了煙梗浸出液培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,模擬了單批次發(fā)酵菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)行為,還進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn);最后將發(fā)酵粗酶液應(yīng)用于降解煙梗果膠,還采用固定化米根霉發(fā)酵煙梗粉末的方法降解煙梗果膠。首先,對(duì)純果膠發(fā)酵產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究。固定化與游離相比發(fā)酵周期減少33%,產(chǎn)酶量提高115%。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到:果膠2.5%,硫酸銨1.5%,ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.15%,K2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.4%,轉(zhuǎn)速190r/min、裝液量50mL/250mL、發(fā)酵溫度30oC、發(fā)酵p H 5.0、孢子濃度0.75×106個(gè)/mL。在單批次發(fā)酵中,固定化米根霉生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)符合Logistic方程,生長(zhǎng)與產(chǎn)酶部分偶聯(lián),24h后果膠酶(PEC)酶活力和聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(Endo-PG)酶活力分別為973.47U/mL和165.08U/mL。半連續(xù)發(fā)酵研究表明在第5批次出現(xiàn)最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力,分別為1 253.95U/mL和181.94U/mL,分別比首次提高29.8%和18.3%,達(dá)到或高于目前固定化細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的水平。其次,對(duì)煙梗浸出液發(fā)酵產(chǎn)果膠酶進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到:煙梗10%,硫酸銨1.5%,ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.1%,K2HPO4 0.2%,KH2PO4 0.2%,發(fā)酵pH 5.0,孢子濃度0.5×106,,發(fā)酵溫度30oC,裝液量50mL,轉(zhuǎn)速170r/min。在單批次發(fā)酵中,發(fā)現(xiàn)固定化米根霉生長(zhǎng)與產(chǎn)酶偶聯(lián),48h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分別為361.27U/mL和49.22U/mL。半連續(xù)發(fā)酵研究表明在第2批次出現(xiàn)最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力,分別為430.83U/mL和51.73U/mL,PEC酶活力比首批次提高22.8%。最后,將發(fā)酵所得粗酶液應(yīng)用于降解煙梗果膠的研究和采用固定化米根霉直接發(fā)酵煙梗粉末的方法降解煙梗果膠。純果膠發(fā)酵所得粗酶液在酶活力600U/mL和液料比20時(shí),煙梗果膠降解率為55.6%,纖維素相對(duì)含量提高130%。煙梗浸液發(fā)酵所得粗酶液在酶活力300U/mL和液料比15時(shí),果膠降解率為37.5%,纖維素相對(duì)含量提高88%。煙梗發(fā)酵研究中,確定培養(yǎng)基為:煙梗2.0%,葡萄糖0.6%,硫酸銨0.3%,ZnSO4 0.6 mmol/L,Tween80 0.1%,K2HPO4 0.2%,KH2PO4 0.2%;在與煙梗浸液發(fā)酵相同培養(yǎng)條件下,24h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分別為342.10U/mL和52.67U/mL。固定化米根霉發(fā)酵煙梗粉末研究表明,96h后煙梗果膠降解率為74.1%,半纖維素降解率為54.5%,纖維素降解率為13.3%�？傊�,本研究基于米根霉利用木質(zhì)纖維素原料中果膠和纖維素的先后順序不同,期望在利用纖維素原料中果膠產(chǎn)果膠酶后,再進(jìn)行纖維素的酶解液產(chǎn)乳酸。本研究實(shí)現(xiàn)了以橘皮果膠、煙梗為原料的固定化米根霉半連續(xù)產(chǎn)果膠酶和降解煙梗中大部分果膠的目標(biāo),不僅有利于解決乳酸生產(chǎn)過(guò)程中果膠帶來(lái)的系列問(wèn)題,還可以產(chǎn)生果膠酶,為米根霉利用天然纖維素資源生產(chǎn)乳酸提供了一種新的微生物的預(yù)處理方法。
【關(guān)鍵詞】：米根霉 果膠 果膠酶 固定化 半連續(xù)化發(fā)酵
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：TQ925.3
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-12
• 1 緒論12-26
• 1.1 問(wèn)題的提出及研究意義12-13
• 1.1.1 問(wèn)題的提出12-13
• 1.1.2 研究意義13
• 1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-23
• 1.2.1 果膠分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)和分類(lèi)13-15
• 1.2.2 纖維素原料中果膠的處理15-16
• 1.2.3 果膠酶分類(lèi)和作用方式16-17
• 1.2.4 果膠酶生產(chǎn)菌種—米根霉17-18
• 1.2.5 真菌PG的誘導(dǎo)表達(dá)18-19
• 1.2.6 微生物產(chǎn)果膠酶條件優(yōu)化研究現(xiàn)狀19
• 1.2.7 固定化細(xì)胞產(chǎn)果膠酶的研究進(jìn)展19-21
• 1.2.8 果膠酶生產(chǎn)過(guò)程中的影響因素21-23
• 1.2.9 果膠酶的應(yīng)用23
• 1.3 本課題研究的目的及主要內(nèi)容23-26
• 1.3.1 研究目的23
• 1.3.2 本課題研究的主要內(nèi)容23-24
• 1.3.3 創(chuàng)新點(diǎn)24-26
• 2 棉布載體固定化發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的研究26-34
• 2.1 前言26
• 2.2 材料和方法26-30
• 2.2.1 菌種26
• 2.2.2 主要儀器和試劑26-27
• 2.2.3 培養(yǎng)基27
• 2.2.4 載體的制備27-28
• 2.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)方法28-29
• 2.2.6 分析方法29-30
• 2.3 結(jié)果分析30-32
• 2.3.1 酶液稀釋倍數(shù)的確定30-31
• 2.3.2 游離發(fā)酵與固定化發(fā)酵的比較31-32
• 2.4 討論32
• 2.4.1 酶液稀釋倍數(shù)對(duì)酶活力測(cè)定準(zhǔn)確性的影響32
• 2.4.2 游離發(fā)酵與固定化發(fā)酵32
• 2.5 小結(jié)32-34
• 3 固定化發(fā)酵果膠酶純果膠培養(yǎng)基的優(yōu)化34-44
• 3.1 前言34
• 3.2 材料和方法34-36
• 3.2.1 菌種34-35
• 3.2.2 主要儀器和試劑35
• 3.2.3 培養(yǎng)基35
• 3.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)方法35
• 3.2.5 分析方法35-36
• 3.3 結(jié)果分析36-42
• 3.3.1 碳源種類(lèi)的選擇36-37
• 3.3.2 果膠濃度選擇37
• 3.3.3 氮源種類(lèi)選擇37-38
• 3.3.4 硫酸銨濃度選擇38-39
• 3.3.5 Tween80對(duì)產(chǎn)酶的影響39
• 3.3.6 金屬離子的對(duì)產(chǎn)酶的影響39-41
• 3.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.4 討論42-43
• 3.4.1 碳源種類(lèi)及果膠濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響42
• 3.4.2 氮源種類(lèi)及碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響42
• 3.4.3 Tween80對(duì)產(chǎn)酶的影響42-43
• 3.4.4 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響43
• 3.4.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析43
• 3.5 小結(jié)43-44
• 4 純果膠培養(yǎng)基半連續(xù)發(fā)酵果膠酶44-56
• 4.1 前言44
• 4.2 材料和方法44-45
• 4.2.1 菌種、主要儀器和試劑44
• 4.2.2 培養(yǎng)基44-45
• 4.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)方法45
• 4.2.4 分析方法45
• 4.3 結(jié)果分析45-52
• 4.3.1 轉(zhuǎn)速的選擇45-46
• 4.3.2 裝液量選擇46
• 4.3.3 溫度選擇46-47
• 4.3.4 初始pH的選擇47-48
• 4.3.5 初始孢子濃度的選擇48
• 4.3.6 固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)行為48-50
• 4.3.7 半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)50
• 4.3.8 粗酶液部分酶學(xué)性質(zhì)50-52
• 4.4 討論52-54
• 4.4.1 轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響52
• 4.4.2 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響52
• 4.4.3 初始孢子濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響52
• 4.4.4 固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)行為分析52-53
• 4.4.5 半連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性53
• 4.4.6 粗酶液部分酶學(xué)性質(zhì)53-54
• 4.5 小結(jié)54-56
• 5 固定化發(fā)酵果膠酶煙梗浸液培養(yǎng)基的優(yōu)化56-62
• 5.1 前言56
• 5.2 材料和方法56-57
• 5.2.1 試劑和設(shè)備56
• 5.2.2 煙梗浸液的制備56-57
• 5.2.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)方法57
• 5.2.4 分析方法57
• 5.3 結(jié)果分析57-61
• 5.3.1 兩種制備煙梗浸液方法的比較57
• 5.3.2 煙梗濃度的選擇57-58
• 5.3.3 硫酸銨濃度的選擇58-59
• 5.3.4 Zn~(2+)離子濃度的選擇59
• 5.3.5 Tween80濃度的選擇59-60
• 5.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)60-61
• 5.4 討論61
• 5.4.1 制備煙梗浸液方法61
• 5.4.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化61
• 5.5 小結(jié)61-62
• 6 煙梗浸液培養(yǎng)基半連續(xù)發(fā)酵果膠酶62-68
• 6.1 前言62
• 6.2 材料和方法62-63
• 6.2.1 試劑和設(shè)備62
• 6.2.2 煙梗浸液的制備62
• 6.2.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)方法62
• 6.2.4 分析方法62-63
• 6.3 結(jié)果分析63-65
• 6.3.1 初始pH的選擇63
• 6.3.2 初始孢子濃度的選擇63-64
• 6.3.3 固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)行為64-65
• 6.3.4 半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)65
• 6.4 討論65-66
• 6.4.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化65
• 6.4.2 固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)行為分析65-66
• 6.4.3 半連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性66
• 6.5 小結(jié)66-68
• 7 生物酶法和微生物法去除煙梗中果膠的優(yōu)化68-80
• 7.1 前言68
• 7.2 材料和方法68-71
• 7.2.1 材料68
• 7.2.2 試劑和設(shè)備68-69
• 7.2.3 分析方法69-71
• 7.3 結(jié)果分析71-77
• 7.3.1 粗酶液A降解煙梗果膠質(zhì)實(shí)驗(yàn)71-72
• 7.3.2 粗酶液B降解煙梗果膠質(zhì)實(shí)驗(yàn)72-73
• 7.3.3 固定化米根霉發(fā)酵煙梗粉末的優(yōu)化73-76
• 7.3.4 煙梗經(jīng)處理后各組分的變化76-77
• 7.4 討論77-78
• 7.4.1 煙梗粉末培養(yǎng)基的優(yōu)化和產(chǎn)酶分析77
• 7.4.2 果膠酶和米根霉去除煙梗果膠的效果77
• 7.4.3 米根霉對(duì)煙梗木質(zhì)纖維素處理效果的分析77-78
• 7.5 小結(jié)78-80
• 8 結(jié)論與展望80-82
• 8.1 結(jié)論80-81
• 8.2 對(duì)后續(xù)工作的展望81-82
• 致謝82-84
• 參考文獻(xiàn)84-92
• 附錄92
• A．作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄92
• B．參與的科研項(xiàng)目92

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