萜類酶的產(chǎn)物不專一性在萜類酶中十分常見(jiàn),并與倍半萜類天然產(chǎn)物的多樣性相關(guān)。對(duì)其突變型研究常常產(chǎn)生與野生型酶不一樣的產(chǎn)物分布結(jié)果,甚至出現(xiàn)新的產(chǎn)物。這與蛋白質(zhì)工程中,通過(guò)設(shè)計(jì)改造蛋白,增強(qiáng)催化活性或獲得新的催化功能相契合,引起了科學(xué)家對(duì)研究萜類酶特別是萜類酶的突變體的興趣。在本文中,我們選取了有代表性的倍半萜合酶Trichodiene合酶（TDS）作為研究對(duì)象,采用計(jì)算模擬的方法對(duì)其主副產(chǎn)物的產(chǎn)生機(jī)制及關(guān)鍵殘基對(duì)酶催化影響機(jī)制進(jìn)行探索。通過(guò)雙層（dual-level）QM/MM模擬方法和密度泛函理論分別對(duì)TDS催化機(jī)制和氣相中反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了理論計(jì)算。選用了三環(huán)副產(chǎn)物α-barbatene作為對(duì)照,與產(chǎn)生兩環(huán)主產(chǎn)物trichodiene反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行比較,探究TDS對(duì)主副產(chǎn)物的化學(xué)選擇根源。研究表明TDS對(duì)于這兩種產(chǎn)物的關(guān)鍵選擇分歧點(diǎn)在于中間體cuprenyl cation,反應(yīng)過(guò)程中關(guān)鍵步驟發(fā)生不同的甲基的轉(zhuǎn)移。合成trichodiene路徑中轉(zhuǎn)移豎直C12甲基,在酶體系中需要跨越8.19 kcal/mol能壘,氣相反應(yīng)經(jīng)歷4.6 kcal/mol能壘。而TDS催化合成α-barbaten... 

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倍半萜烯的2種環(huán)化方式，Trichodiene合成機(jī)制及兩種以TD為前體的毒素

吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文示與Mg2+離子配位）A亞基不含Mg2+-PPi區(qū)，說(shuō)明TDS酶的兩個(gè)亞基可能并不同時(shí)發(fā)生作用。圖1.1倍半萜烯的2種環(huán)化方式，Trichodiene合成機(jī)制及兩種以TD為前體的毒素圖1.2TDS酶結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)[24]4

吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文圖1.3TDS酶產(chǎn)生的主要倍半萜烯產(chǎn)物對(duì)在高度保守的天冬氨酸富集區(qū)（DDXXD）以及倍半萜中常見(jiàn)的NSE區(qū)（NDXXSXXXE）進(jìn)行定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)（表1.2，表1.3）的結(jié)果表示，一些突變?nèi)鏝225D、Y295F，被鑒定出了更加明顯的副產(chǎn)物β-Bisabolene的產(chǎn)生，而D100E突變中發(fā)現(xiàn)以前未檢測(cè)到的一些倍半萜烯產(chǎn)品，α-acoradiene。[26]但同時(shí)突變對(duì)于酶活性造成一定的影響，N225D、S229T以及R304K等突變體kcat明顯下降，而D104E、Y295F等突變型，酶活性基本保持不變。[25,26]造成酶活性降低甚至失活的一個(gè)主要原因是選擇的D100、N225、R304和Y305等殘基主要用于配位Mg2+以及PPi焦磷酸基團(tuán)，這些殘基對(duì)于穩(wěn)定Mg2+、PPi基團(tuán)電荷幫助PPi基團(tuán)從FPP上離去有十分重要的貢獻(xiàn)，突變與Mg2+離子配位或與PPi形成氫鍵的殘基一定程度上會(huì)改變活性口袋的口袋體積大小，導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)不完全關(guān)閉，使得底物提前釋放產(chǎn)生如farnesene和bisabolene等副產(chǎn)物。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)支持該結(jié)論，表明TDS酶催化反應(yīng)中，從酶活性位點(diǎn)釋放trichodiene是整個(gè)反應(yīng)的限速步驟，而中間體(3R)-NPP未被檢測(cè)到，表明NPP的轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度非�？�，那么FPP到NPP的重排是限制TDS酶反應(yīng)途徑中催化速率的關(guān)鍵步驟。[27]而Y295F，并不參與配位，但減少的羥基適當(dāng)增大了活性位點(diǎn)處的孔隙大小，以及，在不影響酶的催化活性的情況下，大大增加了副產(chǎn)物β-Bisabolene的產(chǎn)率。6


本文編號(hào)：3430050