隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（STORM）作為一種超分辨技術(shù),打破了傳統(tǒng)的衍射極限。它是利用可反復(fù)光開關(guān)的熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)的一種超高精度的單分子定位技術(shù)。利用這一原理獲得的超分辨圖像的橫向分辨率可達(dá)20nm,軸向分辨率可達(dá)50nm,比衍射極限提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。由于可以得到超高分辨率的圖像,STORM已經(jīng)成為研究細(xì)胞特征學(xué)的重要工具。但是在組織成像方面,由于組織樣品的高散射性和不均勻性,STORM在生物組織樣品應(yīng)用方面受到阻礙和限制。為了能夠?qū)ι锝M織樣品進(jìn)行STORM超分辨成像,我們一方面通過膨脹技術(shù)使組織樣品均一化,透明化,減少由于散射和自發(fā)熒光造成的高背景;另一方面,我們自主搭建了一套光片照明顯微成像系統(tǒng),其具有成像速度快,光漂白和光損傷小的特點(diǎn)。為了活化熒光染料分子,我們?cè)谡彰鞴饴分幸腚p光子激光。由于雙光子激光的非線性性,可以僅對(duì)視野中心的熒光染料分子起活化作用,減少不在視野中心的熒光染料分子不必要的光漂白。為了提升深度成像分辨率,我們?cè)诔上窆饴分屑尤胱赃m應(yīng)光學(xué),利用閉環(huán)校正算法來校正成像系統(tǒng)本身以及成像緩沖液與成像物鏡折射率不匹配導(dǎo)致的像差,從而實(shí)現(xiàn)厚組織樣品內(nèi)部的三維STORM超分辨成... 

【文章來源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１表達(dá)ｃｏｎｎｅｘｉｎ?４３－ＰａｍＣｈｅｒｒｙ的細(xì)胞球狀體在不同ｚ位置的二維超分辨圖像（被文??獻(xiàn)丨１９］許可引用）??Ｂｅｔｚｉ組［２１］在２０１６照，記法

?第１章緒論???丟失或損壞的影響。２０１８年Ｓａｎｇｊｕｎ?Ｐａｒｋ等人［２５］采用線掃描共聚焦顯微鏡對(duì)樣??■■■??ｍｍｍｍ?＾?ｍ??圖１．２?ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞系中微管的超高分辨率圖像（被文獻(xiàn)丨２２】許可引用）??品進(jìn)行光學(xué)切片，降低了背景噪聲；采用納米形貌中的ＤＮＡ點(diǎn)累積技術(shù)??（ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ），克服了厚樣品中的快速光漂白問題，最終實(shí)現(xiàn)在小鼠腦切片組??織樣品的１００微米深處對(duì)化學(xué)突觸的超分辨成像。Ｊｅｏｎｇｍｉｎ?Ｋｉｍ等人［２６］于２０１９??年介紹了一種單分子傾斜平面顯微鏡（ｏｂＳＴＯＲＭ），它通過傾斜光片照明直接對(duì)??樣品的斜切片成像，為組織樣品和小型完整動(dòng)物提供了一個(gè)增加深度和體積的??單分子定位顯微平臺(tái)。利用該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)６６ｐｍ深處細(xì)胞、秀麗隱桿線蟲生??殖腺、黑腹果蠅幼蟲大腦、小鼠視網(wǎng)膜和大腦切片以及整個(gè)棘魚的超分辨率成??像。??對(duì)于ＳＴＯＲＭ／ＰＡＬＭ這種基于單分子定位的超分辨技術(shù)來說，單個(gè)熒光染??料分子發(fā)出的光子需要經(jīng)過樣品和成像透鏡組之后才被照相機(jī)檢測(cè)到。由于厚??的組織樣品的折射率不均勻，熒光分子發(fā)出的波前通過組織的不同部分和結(jié)構(gòu)，??會(huì)產(chǎn)生彎曲或變形，導(dǎo)致波前的畸變；并且光學(xué)系統(tǒng)固有的缺陷也會(huì)導(dǎo)致波前??畸變Ｐ７］。這些畸變降低了光子攜帶的分子位置信息，實(shí)際扭曲或模糊的點(diǎn)擴(kuò)散??函數(shù)（ＰＳＦ）與假定或模擬的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)模型之間的差異進(jìn)一步加劇了這種定??位偏差。這些都是阻礙單分子定位超分辨技術(shù)在組織樣品中應(yīng)用的重要因素。??伴隨著自適應(yīng)光學(xué)近些年來在顯微鏡中應(yīng)用的發(fā)展，由于自適應(yīng)光學(xué)對(duì)像差的??校正能力，使得搭配自適應(yīng)光學(xué)的成像系統(tǒng)逐漸成為實(shí)現(xiàn)厚的組織樣品中超

?第１章緒論???辨成像的一個(gè)有利的工具。??基于自適應(yīng)光學(xué)的波前校正方法可以通過使用變形鏡（Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ?Ｍｉｒｒｏｒ）??恢復(fù)畸變波前的恒定相位延遲來補(bǔ)償畸變。然而即使有了這些校正，由于波前??校正的可用方法和硬件的復(fù)雜性，實(shí)際的成像深度和單分子三維定位的魯??棒性通常被限制在蓋玻片表面的若干微米內(nèi)。為了克服在組織深處軸向定位精??度下降的問題，Ｍｌｏｄｚｉａｎｏｓｋｉ等人＠］利用自適應(yīng)光學(xué)在不同深度對(duì)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)??施加不同幅度的調(diào)制，從而達(dá)到趨于一致的效果；并開發(fā)出高效的Ｎｅｌｄｅｒ－Ｍｅａｄ??單純形優(yōu)化算法，從而實(shí)現(xiàn)魯邦地組織樣品三維超分辨率體積成像。如圖１．３??所示，該工作實(shí)現(xiàn)了對(duì)３〇ｍｉｔｉ厚腦片樣品的三維超分辨成像一一在阿爾茲海默??癥的老鼠模型中重構(gòu)和可視化ａｍｙｌｏｉｄ－Ｐ細(xì)絲的形態(tài)和納米尺度的細(xì)節(jié)，比例??尺為５ｎｍ。??ｍＳＭ??ＨＢＢＢＢ??Ｉ?ｊ?ＨＢＢＩ??圖１．３對(duì)阿爾茨海畎的老鼠３０ｆｕｎ厚腦片中ａｍｙｌｏｉｄ－ｐ斑塊的三維超分辨成像（被文獻(xiàn)丨３０｜??許可引用）??同時(shí)，先進(jìn)的樣品制備技術(shù)也可以減少組織樣品的背景和散射，提高熒光??探針在免疫標(biāo)記過程中的穿透深度［３１＿３２］。最近，Ｃｈｅｎ等人展示了一種新的方??５??


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