本研究以羊骨粉為原料制備羊骨膠原多肽-鈣螯合物。以游離鈣含量為指標,通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化的方法篩選出酶解效果最好的兩種酶,進行順序酶解;所得酶解液繼續(xù)用乳酸菌進行發(fā)酵,優(yōu)化發(fā)酵條件;在此基礎上對羊骨自身的骨鈣和多肽在一定條件下進行螯合,無水乙醇沉淀獲得膠原多肽-鈣螯合物,并對其結構表征和相關性質進行分析研究。結果如下:(1)篩選最優(yōu)酶:三種酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)水解提取羊骨中可溶性鈣的最佳工藝條件分別為:酶解溫度55℃、40℃、45℃;酶解時間4 h、4 h、5 h;酶解pH 6.0、2.5、7;加酶量5000 U/g、5300 U/g、1500 U/g。平行3次,得到的游離鈣含量分別達到78.30 mg/100g、1008.68 mg/100g、45.68 mg/100g。因此,最后選擇木瓜蛋白酶和胃蛋白酶進行后續(xù)試驗。(2)最優(yōu)兩種蛋白酶的酶解組合為:在兩種酶各自最優(yōu)酶解溫度、酶解pH、加酶量條件下,先木瓜蛋白酶酶解3 h,后胃蛋白酶繼續(xù)酶解3 h,最終得到的游離鈣含量最高,可達到1839.14 mg/100g。(3)酶解液發(fā)酵的最佳工藝條件:葡萄糖添加量3%、接種量6%、發(fā)酵時間24.5h、發(fā)酵溫度37℃和初始pH6.5,其游離鈣含量達到2212.58 mg/100g。(4)鈣螯合能力為42.57±0.09%;肽-鈣螯合物中鈣含量為15.81%±0.06%。(5)紫外吸收光譜分析發(fā)現膠原多肽和鈣螯合后形成螯合物;熒光光譜的變化表明螯合反應可能是側鏈殘基和Ca~(2+)相互作用所引起的;傅立葉變換紅外光譜推測膠原多肽的主要結合位點為肽鏈上的羧基、羥基、氨基,這些基團與Ca~(2+)協同形成肽-鈣螯合物;DSC圖譜上新吸收峰以及X衍射圖譜中新衍射峰的出現都進一步證明了螯合反應的發(fā)生;氨基酸分析表明通過氨基酸的殘基羧基在反應過程中結合鈣;SEM也同樣表明在螯合過程中,由于肽和鈣離子之間的相互作用而改變了肽的初始結構。(6)對肽-鈣螯合物進行穩(wěn)定性研究:肽-鈣螯合物在不同溫度環(huán)境下相對穩(wěn)定;在不同pH環(huán)境下,相對于酸性環(huán)境,中性和堿性環(huán)境下肽-鈣螯合物更穩(wěn)定。(7)對肽-鈣螯合物進行體外消化研究:用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃+胰蛋白酶消化后,相對于對照,肽-鈣螯合物的鈣含量分別降低(P0.05)至87.3±2.3%,73.5±4.2%和57.6±3.8%。結果表明,肽-鈣螯合物在胃腸道環(huán)境中穩(wěn)定,可以促進鈣的吸收。(8)對肽-鈣螯合物抗氧化性做了初步研究:相比膠原多肽來說,肽-鈣螯合物的抗氧化活性提高。本試驗旨在為羊骨的高值利用和相關產品開發(fā)奠定基礎,發(fā)掘其潛在的應用價值。
【學位單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：TS251.94;TQ920.6
【部分圖文】：

甘肅農業(yè)大學2020屆碩士學位論文2掃描電鏡下觀察，發(fā)現它的結晶體積小，密度大，是呈現柱狀結構的，由于其表面積大，因此更加有利于鈣磷元素在骨組織中的交換運輸速度的加快[10]。圖1-1羥基磷灰石陽離子Fig.1-1Hydroxyapatitecation2.骨鈣的提取方法2.1酸解法酸解法是利用一些強酸來破壞骨膠原的原本的高級結構，將其中的Ca10(PO)6(OH)2分解出來，再進一步溶解獲得鈣離子。我們注意到用酸解法提取時，骨鈣被溶出來的同時，骨中的一些其他有毒有害的礦物元素也會溶出，比如鉛、砷、汞等重金屬元素，這些都對人體不利。另外，酸解法獲得的磷酸鹽一般溶解度并不高，因此它的有效吸收和利用通常要在偏酸性的條件下進行，小腸是人機體主要吸收和利用鈣的位置，它呈中性[11]。目前關于酸解法提取骨鈣的報道中發(fā)現，酸解以后的產物鹽含量高，顏色普遍偏深[12]，影響進一步的開發(fā)利用。2.2堿解法堿解法對骨膠原的破壞是很大的，能夠得到含量很高的Ca和P，但是由于破壞程度很大，骨膠原蛋白的損失也很大，不利于蛋白的吸收利用；同時在人體吸收的過程中會很容易和草酸等反應生成不溶性的物質，可能會導致出現結石。堿解法的水解產物也是鹽含量高，顏色較深[13]。

甘肅農業(yè)大學2020屆碩士學位論文6胞的其他支路來發(fā)揮作用，鈣離子也就通過這些支路被吸收利用，在這一過程維生素D是起到一定的促進作用的[40-41]。因此，鈣離子濃度的高低決定了它利用的方式，低濃度的情況主要發(fā)生位置在細胞內，借助腸道內的上皮細胞來實現鈣離子的吸收；高濃度的情況主要發(fā)生位置在細胞以外的地方，主要是各種細胞支路來實現鈣離子的吸收。圖1-2人體內鈣的吸收代謝途徑Fig.1-2Calciumabsorptionandmetabolisminhumanbody4.4鈣制劑的發(fā)展現狀下表為目前鈣制劑的發(fā)展狀態(tài)以及在各階段代表產品和產品的優(yōu)缺點如表1-1所示[42-47]。表1-1鈣制劑的發(fā)展現狀Table1-1Developmentstatusofcalciumpreparations鈣制劑代表性產品優(yōu)點缺點第一代產品以無機鹽為主，碳酸鈣，乳酸鈣和氯化鈣；動物鮮骨等含鈣量高不溶于水，必須經胃酸消化后才能吸收，對胃有強烈的刺激性；堿性胃腸環(huán)境中易于形成鈣沉淀，容易停留在腎臟，引起腎結石或直接被排泄掉，吸收率低，存在毒副作用

甘肅農業(yè)大學2020屆碩士學位論文243.結果與分析3.1木瓜蛋白酶酶解羊骨粉的研究3.1.1pH對游離鈣含量的影響圖3-1酶解pH對游離鈣含量的影響Fig.3-1EffectofEnzymaticpHonFreeCalciumContent注：同一系列的不同字母表示差異性顯著（下同）根據圖3-1可看出酶解pH在5.5-6的范圍內，游離鈣含量與pH是呈正相關的，當木瓜蛋白酶的酶解pH為6時，游離鈣含量達到最高61.854mg/100g，較酶解pH在5.5、7.5時分別提高了20.70%、38.78%（P＜0.01），因為pH為6時，木瓜蛋白酶的活性位點暴露出來的更多，這樣能夠增加有效的酶活力，酶解效果也就更好。游離鈣含量再隨著pH增大呈降低的趨勢，主要因為酶對反應環(huán)境有一定的pH敏感性[119]，酶的空間構象會隨著pH的作用發(fā)生改變，當pH超過6時，酶與蛋白質之間的解離狀態(tài)受到了影響[120]，酶解效果也就下降。所以選擇pH為6進行后續(xù)試驗研究。3.1.2溫度對游離鈣含量的影響
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本文編號：2874023