果實(shí)表皮角質(zhì)層在病原物與寄主互作中具有雙重作用,一方面作為病原物侵染的物理屏障,另一方表皮的物理化學(xué)信號(hào)對(duì)病原物,尤其對(duì)親和性菌株的侵染具有誘導(dǎo)作用,但其調(diào)控機(jī)理尚需進(jìn)一步揭示。本研究以梨果黑斑病菌A.alternata為研究對(duì)象,先通過藥理學(xué)方法研究cAMP特異性抑制劑阿托品對(duì)梨果皮蠟質(zhì)提取物誘導(dǎo)的A.alternata生長(zhǎng)、侵染結(jié)構(gòu)及致病性的影響;進(jìn)一步對(duì)梨果致病真菌A.alternata基因PKAc和PKAr進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,構(gòu)建ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突變株,從分子水平上系統(tǒng)研究了PKAc和PKAr基因?qū).alternata生長(zhǎng)、脅迫響應(yīng)、梨果皮蠟質(zhì)誘導(dǎo)侵染結(jié)構(gòu)的形成和致病性的影響。結(jié)果如下:1.cAMP信號(hào)級(jí)聯(lián)通路抑制劑阿托品處理后顯著抑制了表皮疏水性和蠟質(zhì)介導(dǎo)的A.alternata的孢子萌發(fā)和附著胞形成。其中抑制劑處理后4 h,A.alternata在高疏水性和果蠟涂膜表面附著胞形成率分別較對(duì)照降低了75.3%和63.7%。外源cAMP的處理可部分恢復(fù)其抑制劑的作用,外源cAMP+阿托品處理后4 h,在高疏水性和果蠟涂膜表面,A.alternata附著胞形成率為抑制劑阿托品單獨(dú)處理的2.4倍和1.6倍。2.通過NCBI blast分析和基因克隆,從A.alternata基因組中鑒定出cAMP依賴性蛋白激酶PKA的催化亞基和調(diào)節(jié)亞基,命名為PKAc和PKAr。梨黑斑病菌A.alternata的PKAc和PKAr基因的ORF全長(zhǎng)分別為1571 bp和1737 bp,分別編碼488和461個(gè)氨基酸。各功能結(jié)構(gòu)域和其它真菌PKA激酶催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的同源性較高,PKAc和PKAr均含有其保守RXSY和RRXS結(jié)構(gòu)域。PKAc基因在梨果蠟質(zhì)涂膜表面誘導(dǎo)A.alternata附著胞形成過程中的表達(dá)量顯著高于單獨(dú)疏水膜,而PKAr基因在疏水膜誘導(dǎo)孢子萌發(fā)過程中表達(dá)量顯著上調(diào)。3.采用同源重組策略和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì)A.alternata的PKA激酶催化亞基PKAc和調(diào)節(jié)亞基PKAr進(jìn)行敲除,獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子,經(jīng)過DNA水平和RNA水平的雙重鑒定,最終得到了ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突變株。與A.alternata野生型菌株相比,ΔAaPKAc菌落生長(zhǎng)緩慢,生物量減少、產(chǎn)孢量增加,而ΔAaPKAr喪失了分生孢子形成能力。ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突變株胞內(nèi)cAMP含量升高、PKA含量降低。ΔAaPKAc突變株對(duì)氧化脅迫和滲透脅迫的耐受性增加,對(duì)細(xì)胞壁合成抑制劑的敏感性增強(qiáng),相反,ΔAaPKAr突變株較野生型對(duì)氧化脅迫和滲透脅迫更敏感。此外,ΔAaPKAc與野生型菌株相比在損傷接種的梨果上擴(kuò)展能力降低,且與野生型相比ΔAaPKAc突變株黑色素增加,毒素TEN、ALT、AME和AOH的含量降低,同時(shí)也降低了胞外降解酶Cx和β-葡聚糖酶活性。4.高疏水性和梨果蠟提取物涂膜表面顯著促進(jìn)了A.alternata的孢子萌發(fā)和附著胞形成,ΔAaPKAc相比于野生型菌株顯著降低了表皮疏水性和蠟質(zhì)介導(dǎo)孢子萌發(fā)和附著胞形成,其中對(duì)附著胞形成的抑制效果更加顯著,當(dāng)培養(yǎng)4h后,在高疏水性(108°)和果蠟涂膜表面ΔAaPKAc相比于野生型菌株附著胞形成率分別降低了31.6%和38.3%。洋蔥表皮脫蠟再涂果蠟表面可以顯著促進(jìn)A.alternata附著胞和侵染菌絲的形成。綜上所述,cAMP-PKA信號(hào)通路在梨黑斑病菌A.alternata的生長(zhǎng)、致病性和生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用,且cAMP-PKA信號(hào)通路參與了梨果表皮物化信號(hào)介導(dǎo)的A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：TS255.1
【部分圖文】：

芍本?cm的圓形，滅菌后鋪在IM固體培養(yǎng)基平板(含200μMAS)上。取上述預(yù)培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌和A.alternata孢子各100μL混勻，均勻涂布于玻璃紙上，晾干后于28°C恒溫培養(yǎng)箱中避光共培養(yǎng)44h。然后，將玻璃紙揭下轉(zhuǎn)移到PDA固體培養(yǎng)基平板(含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL)上，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)后，挑取轉(zhuǎn)化子到新的PDA固體培養(yǎng)基平板(含潮霉素250μg/mL，羧芐青霉素鈉500μg/mL)上。將轉(zhuǎn)化子在含抗生素和不含抗生素的平板上傳代接種3次，以確保抗性遺傳穩(wěn)定性。2.6.3敲除突變株的篩選及鑒定圖2陽性轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證方法和引物位置示意圖Fig.2Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused通過對(duì)比野生型菌株與突變株，野生型菌株應(yīng)該沒有HPH片段，突變株包含HPH片段。野生型菌株有目的基因片段，而突變株里沒有目的基因片段。用引物PKAc-up-F和PKAc-down-R驗(yàn)證，突變株的全長(zhǎng)總共為4.4kb，而野生型菌株的全長(zhǎng)為3.5kb，用引物PKAr-up-F和PKAr-down-R驗(yàn)證，突變株的全長(zhǎng)總共為4.4kb，而野生型菌株的全長(zhǎng)為3.7kb。野生型菌株上游并沒有定點(diǎn)插入的Olic片段，而突變株上游應(yīng)該有

cAMP-PKA信號(hào)途徑調(diào)控梨果皮蠟質(zhì)物化信號(hào)誘導(dǎo)Alternariaalternata侵染結(jié)構(gòu)分化的分子機(jī)制28圖3cAMP在疏水性誘導(dǎo)A.alternata對(duì)孢子萌發(fā)率(A)和附著胞形成率(B)的影響.大寫字母表示不同接觸角間差異，小寫字母表示同一接觸角不同處理間差異(P＜0.05).Fig.3EffectsofcAMPonsporegerminationrate(A)andappressoriumformationrate(B)ofAlternariaalternatainducedondifferenthydrophobicsurface.Theverticallineindicatingstandarderror(±SE);uppercaselettersindicatingdifferencesbetweendifferentcontactangles;lowercaselettersindicatingthesamedifferenceincontactanglebetweentreatments(P<0.05).3.1.2cAMP抑制劑阿托品對(duì)蠟質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成的影響分別以蜂蠟（B）和石蠟（P）為對(duì)照，研究A.alternata對(duì)同一疏水表面（接觸角101°）不同蠟質(zhì)表面的響應(yīng)，結(jié)果表明梨果蠟（F）對(duì)A.alternata孢子萌發(fā)率（圖4A）和附著胞形成率（圖4B）的誘導(dǎo)作用比石蠟和蜂蠟強(qiáng)，尤其顯著地刺激了附著胞的形成。在培養(yǎng)4h后，A.alternata在果蠟表面附著胞形成率較石蠟和蜂蠟提高了36.3%和64.7%。cAMP抑制劑atropine處理顯著降低了果蠟、石蠟和蜂蠟誘導(dǎo)A.alternata的孢子萌發(fā)率（圖4A）和附著胞形成率（圖4B），對(duì)附著胞形成率的抑制作用更明顯，其中培養(yǎng)4h在果蠟表面抑制劑atropine與對(duì)照相比附著胞形成率顯著降低了63.7%（p＜0.05）。當(dāng)加入外源性dibutyryl-cAMP后，可以部分恢復(fù)A.alternata的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率，其中對(duì)附著胞的恢復(fù)作用更強(qiáng)，在培養(yǎng)4h時(shí)，果蠟表面外源性dibutyryl-cAMP與抑制劑atropine單獨(dú)處理相比，果蠟表面A.alternata附著胞形成率恢復(fù)了1.6倍。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文29圖4cAMP在蠟質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata對(duì)孢子萌發(fā)率(A)和附著胞形成率(B)的影響.豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE).大寫字母表示不同蠟質(zhì)間差異，小寫字母表示同一蠟質(zhì)不同處理間差異(P＜0.05).Fig.4EffectofcAMPonwax-inducedsporegerminationrate(A)andappressoriumformationrate(B)ofAlernariaalternata.Verticallineindicatingstandarderror(±SE);uppercaselettersindicatingdifferentwaxydifferences;lowercaselettersindicatingthesamedifferenceinwaxytreatment(P<0.05).3.1.3cAMP抑制劑阿托品對(duì)A.alternata菌落生長(zhǎng)的影響使用cAMP抑制劑atropine和外源性dibutyryl-cAMP處理鏈格孢培養(yǎng)基，在1、3、5、7d時(shí)觀察其菌落直徑，發(fā)現(xiàn)atropine處理與對(duì)照組相比，A.alternata的菌落直徑?jīng)]有變化差異（圖5）。此外，加入外源性dibutyryl-cAMP與對(duì)照組相比，A.alternata的菌落直徑也沒有明顯變化。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2867951