本文關(guān)鍵詞：麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子死亡機(jī)制的探究　出處：《河南科技學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 黃曲霉 凋亡 電壓門控鉀離子通道 ROS

【摘要】：黃曲霉(Aspergillus flavus)作為一種腐生絲狀致病真菌,常見于發(fā)霉的糧食和豆類和堅(jiān)果表面,其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(aflatoxins)對(duì)人類和動(dòng)物的肝臟具有很強(qiáng)的致癌性能夠?qū)е缕淇焖偎劳觥Ｒ恍┛咕鷦?伏立康唑)常用于治療黃曲霉的感染。然而,最近研究表明黃曲霉對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥性從而導(dǎo)致臨床治療真菌感染的失敗。因此,深層次地了解黃曲霉的死亡機(jī)制有助于新的殺菌藥物研發(fā)。麝香草酚(Thymol),主要存在于唇形科百里香屬植物中,是百里香屬植物精油的主要成分。研究表明麝香草酚可以有效抑制細(xì)菌、霉菌和酵母的生長。本研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚能夠誘導(dǎo)黃曲霉孢子的裂解死亡,為了進(jìn)一步探究其作用機(jī)理,本文深度研究了麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子的死亡方式以及可能的作用靶標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:1.麝香草酚對(duì)黃曲霉的殺菌效應(yīng)麝香草酚對(duì)黃曲霉表現(xiàn)出了高效的抑菌效應(yīng):當(dāng)濃度大于80μg/ml幾乎完全抑制黃曲霉孢子的生長。通過孢子活力分析發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致超過99.9%的黃曲霉孢子死亡。掃描電鏡結(jié)果顯示麝香草酚能夠?qū)е曼S曲霉孢子發(fā)生裂解。ROS和NO作為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子,經(jīng)常被報(bào)道與細(xì)胞的死亡相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的麝香草酚可以誘導(dǎo)黃曲霉孢子產(chǎn)生大量的ROS和NO,而且ROS和NO產(chǎn)生的抑制劑均可以顯著降低麝香草酚的這種殺菌效應(yīng)。ROS抑制劑還可以抑制NO產(chǎn)生。由此可見ROS可能通過誘導(dǎo)NO產(chǎn)生,參與麝香草酚對(duì)黃曲霉孢子的致死作用。2.麝香草酚導(dǎo)致黃曲霉孢子的死亡方式為細(xì)胞凋亡真核細(xì)胞的死亡方式包含多種,總的來講包含細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。通過Hoechst33342和PI雙染,我們采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡對(duì)麝香草酚處理后黃曲霉孢子的早期生理活動(dòng)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明麝香草酚處理3h孢子就開始發(fā)生凋亡;并且隨著時(shí)間延長凋亡比例顯著增加,在處理6h后大部分孢子已處于凋亡狀態(tài)。通過Tunnel染色發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理9h后黃曲霉孢子出現(xiàn)了凋亡的另外一個(gè)特征:DNA斷裂現(xiàn)象;通過JC-1熒光探針標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致線粒體的膜電位減弱,這說明線粒體膜可能受到了損傷。真核生物線粒體損傷會(huì)釋放細(xì)胞色素c到細(xì)胞質(zhì)中并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通過caspase 9檢測試劑盒,我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理后黃曲霉孢子中caspase 9的活性急劇增加通過使用不可逆的Caspase廣譜抑制劑氟甲基酮(Z-VAD-FMK)抑制Caspase的活性,發(fā)現(xiàn)caspase 9的活性受到顯著抑制,而且發(fā)生細(xì)胞凋亡的孢子數(shù)量明顯減少。這就進(jìn)一步表明麝香草酚可能誘導(dǎo)黃曲霉孢子線粒體損傷最終導(dǎo)致了凋亡發(fā)生。3.電壓門控鉀離子通道參與孢子凋亡為了進(jìn)一步探索麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡的潛在靶標(biāo),我們?cè)谌梭w蛋白-藥物互作數(shù)據(jù)庫DRAR-CPI中檢索能夠與麝香草酚進(jìn)行分子互作的蛋白。從中發(fā)現(xiàn)人體中電壓門控鉀離子通道蛋白(PDB id:1ZSX)可以與麝香草酚誘互作,而且與黃曲霉中的KCNAB具有較高的同源性。電壓門控鉀離子通道蛋白經(jīng)常被報(bào)道與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)有關(guān)。隨后我們通過同源建模構(gòu)建了KCNAB的三級(jí)結(jié)構(gòu),并通過模擬分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)麝香草酚與黃曲霉的KCNAB的互作,發(fā)現(xiàn)其作用方式跟其與人體1ZSX中的作用方式類似。通過K+熒光探針PBFI標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)麝香草酚處理導(dǎo)致孢子內(nèi)鉀離子濃度瞬間升高;當(dāng)外源添加電壓門控鉀離子通道抑制劑(4-氨基吡啶)時(shí)可以抑制鉀離子濃度的增高,而且同時(shí)顯著降低了凋亡的孢子數(shù)量。這些結(jié)果有力支持了生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果:麝香草酚可以與KCNAB互作,其結(jié)果促進(jìn)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡。4.黃曲霉KCNAB的敲除體的構(gòu)建鑒于KCNAB在麝香草酚誘導(dǎo)黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡中的作用,我們研究了KCNAB在黃曲霉的一些生理功能。我們使用黃曲霉CA14Δpyr G ku70作為母本菌株構(gòu)建了缺失突變體ΔKCNAB。結(jié)果顯示KCNAB缺失導(dǎo)致黃曲霉孢子萌發(fā)紊亂:在蒸餾水中萌發(fā)而在培養(yǎng)中萌發(fā)受阻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺失突變體對(duì)洋蔥表皮和花生的侵染力顯著降低。這很可能是由于KCNAB作為電壓門控鉀離子通道β亞基其缺失會(huì)導(dǎo)致通道對(duì)外界刺激過度反應(yīng)。使用麝香草酚處理突變體,發(fā)現(xiàn)突變體的K+激發(fā)現(xiàn)象更加明顯,而且凋亡現(xiàn)象更加顯著。這不僅證實(shí)了我們關(guān)于通道過度反應(yīng)的猜想,而且進(jìn)一步支持了電壓門控鉀離子通道蛋白參與了麝香草酚導(dǎo)致黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡。通過上述試驗(yàn),我們的研究表明麝香草酚處理首先導(dǎo)致鉀離子的爆發(fā),進(jìn)而引起了線粒體損傷、ROS的產(chǎn)生、Caspase的激活,最終導(dǎo)致孢子發(fā)生細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果證明電壓門控鉀離子通道蛋白β亞基可以作為靶標(biāo),應(yīng)用于抗黃曲霉感染新藥開發(fā)和抗黃曲霉毒素污染控制的策略制定。
[Abstract]:In order to study the mechanism of death of Aspergillus fumigatus , it is found that muscarol can induce the death of Aspergillus fumigatus . The results show that muscarol can induce the death of Aspergillus fumigatus . It was found that the K + challenge of the mutant was more obvious and the apoptosis was more significant . This not only confirmed our conjecture about the over - reaction of the channels , but also supported the involvement of the voltage gated potassium channel protein in the apoptosis of Aspergillus . Through the above experiments , we have shown that the treatment of the potassium ion channel caused the damage of mitochondria , the production of ROS , the activation of Caspase , and the apoptosis of the spores . The results show that the voltage gated potassium channel protein 尾 subunit can be used as a target , and it can be applied to the development of anti - Aspergillus infection and the strategy of anti - aflatoxin pollution control .

【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ460.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡雯鈞;;麝香草酚法測定水中硝酸鹽[J];鐵道勞動(dòng)安全衛(wèi)生與環(huán)保;1987年03期

2 楊澤榆,鄧衛(wèi)慈;麝香草酚的合成[J];催化學(xué)報(bào);1990年01期

3 周振鶴;;巴比妥(鈉)的自制及麝香草酚的提純[J];遼寧中級(jí)醫(yī)刊;1981年05期

4 余遠(yuǎn)碧,馮俊華;甲基麝香草酚蘭光度法測定頭發(fā)中鈣的探討[J];中國公共衛(wèi)生;1992年11期

5 王娣;謝海偉;曹珂珂;柯春林;錢時(shí)權(quán);石亞中;任茂生;;麝香草酚抑菌活性及其影響因素研究[J];食品工業(yè)科技;2012年14期

6 吳剛珂;劉晶;張青;顏承農(nóng);劉義;;麝香草酚的熒光光譜研究[J];分析測試學(xué)報(bào);2008年01期

7 凌偉軍;余倩;黃淋佳;余林;麥裕良;林探廳;;柱層析分離提純麝香草酚的研究[J];食品工業(yè)科技;2010年07期

8 徐紫君,周堅(jiān)勇;麝香草酚蘭褪色測定水中的二氧化氯[J];中國公共衛(wèi)生;2004年02期

9 陳開林,陳開梅;麝香草酚比色法檢測硝酸鹽的改進(jìn)[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年03期

10 黃淋佳;余林;余倩;成曉玲;麥裕良;蘭芳;孫明;凌偉軍;;介孔分子篩催化合成麝香草酚[J];化工進(jìn)展;2009年S2期

相關(guān)會(huì)議論文 前2條

1 董瑞華;梁宇光;朱亮亮;梁思成;房中則;葛廣波;楊凌;劉澤源;;異麝香草酚在人肝和腸道葡萄糖醛酸化代謝中代謝酶的鑒定[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

2 黃淋佳;余林;余倩;成曉玲;麥裕良;蘭芳;孫明;凌偉軍;;介孔分子篩催化合成麝香草酚[A];中國化工學(xué)會(huì)2009年年會(huì)暨第三屆全國石油和化工行業(yè)節(jié)能節(jié)水減排技術(shù)論壇會(huì)議論文集（下）[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 ;奧來可對(duì)子豬促生長的作用原理及使用方法[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 魏正凱;麝香草酚對(duì)金葡菌誘發(fā)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護(hù)作用及機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

2 蘇柏華;洗必泰麝香草酚涂膜的防齲實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2006年

，

本文編號(hào)：1401108