本文關(guān)鍵詞：基于DNAzyme和EXO Ⅲ信號擴增技術(shù)構(gòu)建高靈敏的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器及其應(yīng)用研究　出處：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：電化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated Chemiluminescence,ECL)又稱電致化學(xué)發(fā)光,是電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的產(chǎn)物,由于具有操作簡單快速、時空可控性好、檢測靈敏度高等優(yōu)點,已經(jīng)成為分析科學(xué)最熱門的領(lǐng)域之一。傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、聯(lián)吡啶釕、芳香烴類等。進入21世紀(jì)后,在此基礎(chǔ)上,為了提高傳統(tǒng)的發(fā)光物質(zhì)的電子發(fā)光效率,引入了量子點、半導(dǎo)體材料,關(guān)于ECL的各種研究日新月異。1996年,科研工作者首次提出"分子信標(biāo)"這一概念。因分子信標(biāo)呈獨特的發(fā)夾結(jié)構(gòu),所以有良好的穩(wěn)定性,又因堿基互補配對原則,有良好的特異性。分子信標(biāo)主要分為熒光分子信標(biāo)和電化學(xué)分子信標(biāo)。熒光分子信標(biāo)在莖部的兩端標(biāo)記熒光基團和猝滅基團,當(dāng)沒有目標(biāo)時,熒光基團和猝滅基團距離非常近,發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,熒光被猝滅;當(dāng)有目標(biāo)時,目標(biāo)與信標(biāo)形成雙鏈雜交體,熒光基團和猝滅基團的距離拉開,熒光基團恢復(fù)熒光,產(chǎn)生信號。由于分子信標(biāo)具有設(shè)計靈活多變、合成簡單、特異性識別能力強等優(yōu)點,已經(jīng)在生物大分子檢測領(lǐng)域取得廣泛應(yīng)用。我們實驗組在前面探究的基礎(chǔ)上,結(jié)合電化學(xué)發(fā)光技術(shù)和分子信標(biāo)技術(shù)研制出了新型的電化學(xué)發(fā)光催化活性開關(guān)信標(biāo)(ECL-MB),結(jié)合核酸適配體技術(shù),再結(jié)合EXO Ⅲ和DNAzyme酶信號擴增技術(shù),構(gòu)建了一種基于EXO Ⅲ和DNAzyme酶信號擴增的高靈敏電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。應(yīng)用該生物傳感器檢測凝血酶和UDG酶,本方案操作簡單快速、檢測靈敏度高,ECL-MB在復(fù)雜環(huán)境中仍能保持良好的生物活性與穩(wěn)定性,有望在活體檢測中取得更廣泛的應(yīng)用,在生物檢測方面有良好的前景。該方法在電化學(xué)發(fā)光技術(shù)和分子信標(biāo)技術(shù)的各自領(lǐng)域取得了進一步發(fā)展,也對兩種技術(shù)的結(jié)合提供了新的思路。第一章緒論在本章,我們首先介紹了電化學(xué)發(fā)光的基本原理以及它的相關(guān)背景,傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和當(dāng)今各種新技術(shù)的結(jié)合使ECL技術(shù)在各個領(lǐng)域有了更廣泛的應(yīng)用。然后介紹了分子信標(biāo)的基本知識和研究進展,分子信標(biāo)技術(shù)在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。最后介紹了我們實驗室研制的新型電化學(xué)發(fā)光催化活性開關(guān)信標(biāo)(ECL-MB)及其工作機理。第二章基于8-17 DNAzyme信號擴增構(gòu)建高靈敏電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測凝血酶在本章,基于8-17DNAzyme酶信號擴增技術(shù)結(jié)合核酸適配體技術(shù),我們構(gòu)建了一種高靈敏電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于凝血酶的檢測。合成的電化學(xué)發(fā)光催化活性開關(guān)信標(biāo)(ECL-MB)的莖部兩端均標(biāo)記具有催化活性的卟啉鐵(hemin)。在無目標(biāo)時,ECL-MB以發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在,hemin以穩(wěn)定的二聚體形式存在,ECL-MB的催化活性開關(guān)關(guān)閉,無法催化魯米諾發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng),ECL信號很低。當(dāng)存在凝血酶時,凝血酶與probe作用,釋放出8-17DNAzyme鏈,8-17DNAzyme繼續(xù)與ECL-MB反應(yīng),在Zn2+的催化下,ECL-MB斷裂,hemin恢復(fù)單體形態(tài),催化魯米諾發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng),ECL信號劇增。實驗結(jié)果表明,該方法可以簡單快速,高靈敏的檢測凝血酶,在10pM-lnM之間,ECL信號與凝血酶濃度之間呈良好的線性關(guān)系。第三章基于EXOⅢ剪切信號放大構(gòu)建高靈敏電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測UDG酶在本章,我們設(shè)計了 一種基于Exonuclease Ⅲ酶剪切信號放大的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于檢測UDG酶的活性。該方案中,我們首先設(shè)計了一條ds-DNA,命名為probe1,由S1和S2鏈構(gòu)成,S2鏈中含有U堿基,在目標(biāo)物UDG酶的剪切下,probe1的雙鏈結(jié)構(gòu)遭到破壞,釋放出S1鏈。S1鏈再與probe2(S3/S4)作用,在Exonuclease Ⅲ酶的作用下,形成兩個循環(huán),釋放出S3鏈。S3鏈再與ECL-MB作用,形成ECL-MB/S3雜交體,ECL-MB由發(fā)夾結(jié)構(gòu)變?yōu)殡p鏈結(jié)構(gòu),hemin二聚體形式遭到破壞,恢復(fù)成hemin單體形態(tài),電化學(xué)發(fā)光催化活性恢復(fù),催化魯米諾-H202體系,產(chǎn)生強烈的ECL信號。該電化學(xué)發(fā)光生物傳感器應(yīng)用于對UDG酶的檢測,表現(xiàn)出了極高的靈敏度和選擇性,最低檢出限可達(dá)到1.3×10-5U/mL。該方法能特異性檢測識別UDG酶,即使是在UDG酶濃度很低的環(huán)境中,亦表現(xiàn)出了良好的抗干擾性。同時應(yīng)用本方法檢測了 Hela細(xì)胞,MCF-7細(xì)胞中的UDG酶,在實際生物樣品檢測中取得進一步發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

【參考文獻】

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1 李超;新型催化比色信標(biāo)及其應(yīng)用研究[D];華東師范大學(xué);2015年

2 劉婷;新型電化學(xué)活性及催化活性分子信標(biāo)開關(guān)的研制及其應(yīng)用研究[D];華東師范大學(xué);2014年

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本文編號：1320956