本文關(guān)鍵詞：microRNA光電化學(xué)檢測及應(yīng)用研究

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【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非蛋白編碼的RNA,它們廣泛存在于動植物體中,并且可以在動植物生長的不同階段調(diào)控著一些基因的表達(dá)。其主要通過與這些基因的信使RNA的特定區(qū)域互補(bǔ)雜交而引起后者的降解或翻譯抑制,從而在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)水平。許多研究報道已經(jīng)證實(shí),miRNA表達(dá)異常與很多疾病的發(fā)生和植物個體的生長有著直接或者間接的關(guān)系,例如:各種癌癥等。但由于動植物體內(nèi)成熟的miRNA很小,核酸序列相似度非常高,并且在細(xì)胞中的表達(dá)水平非常低,這便使得對miRNA的檢測異常困難。目前,miRNA的檢測方法主要有Northern blotting法、微陣列芯片法、實(shí)時熒光定量PCR法等。Northern blotting操作復(fù)雜、耗費(fèi)人力、而且靈敏度較低,分析檢測時樣品的需求量較大并且需要多步的分離富集,其對RNase的污染也非常敏感。微陣列芯片的生產(chǎn)制作和檢測消耗的成本較高,每個芯片上所檢測的樣品體積很小,這大大降低了其靈敏度。實(shí)時熒光定量PCR的選擇性較低并會放大非線性目標(biāo),這將會導(dǎo)致對基因表達(dá)檢測的失真,因此該方法主要用于定量檢測miRNA前體的表達(dá),而不常用于定量檢測成熟的miRNA表達(dá)。綜上所述,建立準(zhǔn)確性好,靈敏度高,操作簡單的miRNA檢測方法意義重大。本文基于Bi2S3-納米金復(fù)合材料和鎢酸銅-氧化銅復(fù)合材料以及T7核酸外切酶等特異性功能,并結(jié)合酶催化、酶循環(huán)放大等技術(shù),制備了三種電化學(xué)生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了miRNA的超靈敏檢測。(1)基于硫化鉍-納米金復(fù)合光電材料、雙螺旋特異性核酸酶(DSN)以及堿性磷酸酯酶催化底物原位生成電子供體的信號擴(kuò)增技術(shù),制備了一種靈敏的光電化學(xué)生物傳感器,實(shí)現(xiàn)對microRNA-21的高靈敏性和高選擇性檢測,并將該方法成功應(yīng)用于檢測感染禽白血病病毒細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)水平的變化。以ITO為基體電極,硫化鉍為光電轉(zhuǎn)換材料,納米金為光電子轉(zhuǎn)移促進(jìn)劑,生物素修飾的DNA為探針。該探針與microRNA-21雜交后,形成剛性雙鏈。再通過生物素與親和素之間的特意相互作用,將親和素鏈接的堿性磷酸酯酶修飾到電極上。通過堿性磷酸酯酶對L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽的水解作用,產(chǎn)生電子供體抗壞血酸。本實(shí)驗(yàn)使用能夠特異性水解DNA-RNA雜交體中DNA的DSN酶來水解固定在電極表面的探針DNA,從而使microRNA-21釋放出來。釋放出來的microRNA-21繼續(xù)和未雜交的探針DNA雜交,形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。經(jīng)過DSN酶水解后,電極表面的探針DNA數(shù)量減少,進(jìn)而減少了堿性磷酸酯酶的修飾量,光電流降低。研究發(fā)現(xiàn),microrna-21濃度的對數(shù)值在1-500fm范圍內(nèi)與光電流成反比關(guān)系,檢測限為0.35fm。該傳感器還實(shí)現(xiàn)了對感染了不同時間的禽白血病病毒的細(xì)胞中提取的總rna中microrna-21表達(dá)量的檢測,結(jié)果表明隨著感染病毒時間的增加microrna-21在染病細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。本研究所提出的這種新型的檢測microrna-21策略開發(fā)出了光電化學(xué)生物傳感器在可見光照射下檢測寡聚核苷酸的新方法。(2)基于t4rna連接酶2和t7核酸外切酶,利用兩步等溫循環(huán)擴(kuò)增的方法構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器來靈敏檢測microrna-21,并成功用于檢測正常人與胃癌患者血清中microrna-21的表達(dá)水平差異。microrna-21、dna2與dna1雜交后,t4rna連接酶2將microrna和dna2連接起來,此時,t7核酸外切酶水解雙鏈中的dna1,釋放出連接反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈核酸又可以與完整的dna1雜交,形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。當(dāng)反應(yīng)剩余的dna1與dna3混合后,兩者便會互補(bǔ)雜交,此時t7核酸外切酶水解消化dna3,釋放出dna1,又與dna3雜交,再次形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。最后,將反應(yīng)剩余的dna3固定在金電極表面。使用dpv檢測標(biāo)記在dna3上的電化學(xué)響應(yīng)分子—二茂鐵。以此,microrna-21的濃度就可以通過檢測二茂鐵的氧化電流的變化來實(shí)現(xiàn)。該方法的檢測限可以達(dá)到0.36fm,檢測范圍為1-105fm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,胃癌患者血清中microrna-21的表達(dá)水平較正常人血清中的明顯上調(diào)。因此,microrna-21可作為診斷胃癌的新型標(biāo)志物。本研究為microrna的檢測、胃癌的預(yù)防及診斷提供了新的途徑。(3)以鎢酸銅-氧化銅復(fù)合材料為光電響應(yīng)材料,將其修飾在導(dǎo)電玻璃上作為檢測電極。利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),磷酸根與phos-tag的特異性識別以及生物素和親和素的特異性識別作用以及堿性磷酸酯酶水解l-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸作為電子供體,構(gòu)建了一種靈敏光電化學(xué)生物傳感器,可以靈敏檢測microrna-319a,并將其成功應(yīng)用于檢測外源植物激素對水稻幼苗葉片中的microrna-319a表達(dá)水平的影響。通過x-射線衍射(xrd)和掃描電鏡圖譜(sem)對所制備的鎢酸銅-氧化銅進(jìn)行表征,結(jié)果表明所制備的材料具有較好的三斜晶型。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以計(jì)算出光暗電流差值與目標(biāo)核苷酸濃度之間的線性關(guān)系為?i(na)=69.61logc(fm)+33.36,檢測限為0.13fm(s/n=3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,赤霉素使水稻幼苗葉片中microrna-319a的表達(dá)上調(diào),脫落酸和6-芐基嘌呤使microrna-319a表達(dá)下調(diào),而吲哚乙酸和吲哚丙酸則對microrna-319a表達(dá)基本沒有影響。這說明mirna-319a會參與赤霉素,脫落酸和6-芐基嘌呤這些植物激素的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),而不會參與吲哚乙酸和吲哚丙酸的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。這為研究microRNA參與植物激素調(diào)控水稻幼苗葉片發(fā)育的路徑提供了新的研究方法和技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1284497