本文關(guān)鍵詞：microRNA光電化學(xué)檢測(cè)及應(yīng)用研究

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【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非蛋白編碼的RNA,它們廣泛存在于動(dòng)植物體中,并且可以在動(dòng)植物生長(zhǎng)的不同階段調(diào)控著一些基因的表達(dá)。其主要通過(guò)與這些基因的信使RNA的特定區(qū)域互補(bǔ)雜交而引起后者的降解或翻譯抑制,從而在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)水平。許多研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí),miRNA表達(dá)異常與很多疾病的發(fā)生和植物個(gè)體的生長(zhǎng)有著直接或者間接的關(guān)系,例如:各種癌癥等。但由于動(dòng)植物體內(nèi)成熟的miRNA很小,核酸序列相似度非常高,并且在細(xì)胞中的表達(dá)水平非常低,這便使得對(duì)miRNA的檢測(cè)異常困難。目前,miRNA的檢測(cè)方法主要有Northern blotting法、微陣列芯片法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。Northern blotting操作復(fù)雜、耗費(fèi)人力、而且靈敏度較低,分析檢測(cè)時(shí)樣品的需求量較大并且需要多步的分離富集,其對(duì)RNase的污染也非常敏感。微陣列芯片的生產(chǎn)制作和檢測(cè)消耗的成本較高,每個(gè)芯片上所檢測(cè)的樣品體積很小,這大大降低了其靈敏度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的選擇性較低并會(huì)放大非線性目標(biāo),這將會(huì)導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)檢測(cè)的失真,因此該方法主要用于定量檢測(cè)miRNA前體的表達(dá),而不常用于定量檢測(cè)成熟的miRNA表達(dá)。綜上所述,建立準(zhǔn)確性好,靈敏度高,操作簡(jiǎn)單的miRNA檢測(cè)方法意義重大。本文基于Bi2S3-納米金復(fù)合材料和鎢酸銅-氧化銅復(fù)合材料以及T7核酸外切酶等特異性功能,并結(jié)合酶催化、酶循環(huán)放大等技術(shù),制備了三種電化學(xué)生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了miRNA的超靈敏檢測(cè)。(1)基于硫化鉍-納米金復(fù)合光電材料、雙螺旋特異性核酸酶(DSN)以及堿性磷酸酯酶催化底物原位生成電子供體的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù),制備了一種靈敏的光電化學(xué)生物傳感器,實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA-21的高靈敏性和高選擇性檢測(cè),并將該方法成功應(yīng)用于檢測(cè)感染禽白血病病毒細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)水平的變化。以ITO為基體電極,硫化鉍為光電轉(zhuǎn)換材料,納米金為光電子轉(zhuǎn)移促進(jìn)劑,生物素修飾的DNA為探針。該探針與microRNA-21雜交后,形成剛性雙鏈。再通過(guò)生物素與親和素之間的特意相互作用,將親和素鏈接的堿性磷酸酯酶修飾到電極上。通過(guò)堿性磷酸酯酶對(duì)L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽的水解作用,產(chǎn)生電子供體抗壞血酸。本實(shí)驗(yàn)使用能夠特異性水解DNA-RNA雜交體中DNA的DSN酶來(lái)水解固定在電極表面的探針DNA,從而使microRNA-21釋放出來(lái)。釋放出來(lái)的microRNA-21繼續(xù)和未雜交的探針DNA雜交,形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)DSN酶水解后,電極表面的探針DNA數(shù)量減少,進(jìn)而減少了堿性磷酸酯酶的修飾量,光電流降低。研究發(fā)現(xiàn),microrna-21濃度的對(duì)數(shù)值在1-500fm范圍內(nèi)與光電流成反比關(guān)系,檢測(cè)限為0.35fm。該傳感器還實(shí)現(xiàn)了對(duì)感染了不同時(shí)間的禽白血病病毒的細(xì)胞中提取的總rna中microrna-21表達(dá)量的檢測(cè),結(jié)果表明隨著感染病毒時(shí)間的增加microrna-21在染病細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。本研究所提出的這種新型的檢測(cè)microrna-21策略開發(fā)出了光電化學(xué)生物傳感器在可見(jiàn)光照射下檢測(cè)寡聚核苷酸的新方法。(2)基于t4rna連接酶2和t7核酸外切酶,利用兩步等溫循環(huán)擴(kuò)增的方法構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器來(lái)靈敏檢測(cè)microrna-21,并成功用于檢測(cè)正常人與胃癌患者血清中microrna-21的表達(dá)水平差異。microrna-21、dna2與dna1雜交后,t4rna連接酶2將microrna和dna2連接起來(lái),此時(shí),t7核酸外切酶水解雙鏈中的dna1,釋放出連接反應(yīng)產(chǎn)生的單鏈核酸又可以與完整的dna1雜交,形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。當(dāng)反應(yīng)剩余的dna1與dna3混合后,兩者便會(huì)互補(bǔ)雜交,此時(shí)t7核酸外切酶水解消化dna3,釋放出dna1,又與dna3雜交,再次形成等溫循環(huán)擴(kuò)增。最后,將反應(yīng)剩余的dna3固定在金電極表面。使用dpv檢測(cè)標(biāo)記在dna3上的電化學(xué)響應(yīng)分子—二茂鐵。以此,microrna-21的濃度就可以通過(guò)檢測(cè)二茂鐵的氧化電流的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。該方法的檢測(cè)限可以達(dá)到0.36fm,檢測(cè)范圍為1-105fm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,胃癌患者血清中microrna-21的表達(dá)水平較正常人血清中的明顯上調(diào)。因此,microrna-21可作為診斷胃癌的新型標(biāo)志物。本研究為microrna的檢測(cè)、胃癌的預(yù)防及診斷提供了新的途徑。(3)以鎢酸銅-氧化銅復(fù)合材料為光電響應(yīng)材料,將其修飾在導(dǎo)電玻璃上作為檢測(cè)電極。利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),磷酸根與phos-tag的特異性識(shí)別以及生物素和親和素的特異性識(shí)別作用以及堿性磷酸酯酶水解l-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸作為電子供體,構(gòu)建了一種靈敏光電化學(xué)生物傳感器,可以靈敏檢測(cè)microrna-319a,并將其成功應(yīng)用于檢測(cè)外源植物激素對(duì)水稻幼苗葉片中的microrna-319a表達(dá)水平的影響。通過(guò)x-射線衍射(xrd)和掃描電鏡圖譜(sem)對(duì)所制備的鎢酸銅-氧化銅進(jìn)行表征,結(jié)果表明所制備的材料具有較好的三斜晶型。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以計(jì)算出光暗電流差值與目標(biāo)核苷酸濃度之間的線性關(guān)系為?i(na)=69.61logc(fm)+33.36,檢測(cè)限為0.13fm(s/n=3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,赤霉素使水稻幼苗葉片中microrna-319a的表達(dá)上調(diào),脫落酸和6-芐基嘌呤使microrna-319a表達(dá)下調(diào),而吲哚乙酸和吲哚丙酸則對(duì)microrna-319a表達(dá)基本沒(méi)有影響。這說(shuō)明mirna-319a會(huì)參與赤霉素,脫落酸和6-芐基嘌呤這些植物激素的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),而不會(huì)參與吲哚乙酸和吲哚丙酸的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。這為研究microRNA參與植物激素調(diào)控水稻幼苗葉片發(fā)育的路徑提供了新的研究方法和技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O657

【參考文獻(xiàn)】

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