本文關(guān)鍵詞：元基因組文庫(kù)中食品工業(yè)酶基因的篩選及脫鹵酶的克隆表達(dá)

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【摘要】：元基因組文庫(kù)指的是從環(huán)境中直接提取混合微生物的基因組DNA克隆到宿主細(xì)胞中,構(gòu)建得到的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù),相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,元基因組文庫(kù)可以更全面的認(rèn)識(shí)和獲得環(huán)境中的微生物基因資源,而這些微生物基因資源可以為新資源食品應(yīng)用,醫(yī)藥開(kāi)發(fā)等工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。長(zhǎng)期在堿性環(huán)境中生存的微生物進(jìn)化出了獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制,體內(nèi)可能擁有極端嗜堿酶基因,對(duì)這些嗜堿微生物進(jìn)行多樣性的分析以及功能基因的篩選,有助于我們了解極端環(huán)境下微生物的代謝機(jī)制,并獲得具有食品應(yīng)用價(jià)值的極端嗜堿酶基因。脫鹵酶能夠催化有機(jī)鹵素化合物中碳-鹵鍵裂解,使鹵素原子從化合物中釋放出來(lái)。脫鹵酶能夠通過(guò)去除有機(jī)氯農(nóng)藥中的氯,從而消除其毒性,這對(duì)治理我國(guó)曾大量使用過(guò)的有機(jī)氯農(nóng)藥(二氯苯氧基乙酸、三氯苯酚、六六六等)的殘留問(wèn)題具有重要應(yīng)用價(jià)值。脫鹵酶可應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果,茶葉以及中成藥中含氯農(nóng)藥殘留的清除和檢測(cè)；脫鹵酶還可應(yīng)用于含氯毒劑(芥子氣)的脫毒處理,這對(duì)于一些遺留化合物無(wú)害處理,保護(hù)環(huán)境安全具有重要意義。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的脫鹵酶由于在催化活性、酶穩(wěn)定性、產(chǎn)率等方面具有很大缺陷,因此開(kāi)發(fā)新一代高活力,高穩(wěn)定性以及高效表達(dá)的脫鹵酶具有重要應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。本論文作了如下研究：對(duì)湖南沅江明星麻廠堿性池進(jìn)行了樣品采集,提取土壤總DNA,用16SrRNA的方法分析了該池微生物多樣性。分析結(jié)果表明,該微生物類群包含變形菌門、厚壁菌門以及擬桿菌門的細(xì)菌以及廣古菌門的古菌。其中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌種BacA1和BacB1與Sulfuropirillum alkalitolerans和Shewanella putrefacien s的相似性分別為98%和98%。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌BacB1與Shewanella putrefaciens以及 Shewanella hafniensis相似性均為98%；優(yōu)勢(shì)古菌甲烷八疊球菌Methanosarcinamazei為厭氧產(chǎn)甲烷古菌�？梢岳肏2/C02、醋酸鹽、甲醇、甲胺、三甲胺為碳源產(chǎn)生甲烷。在有機(jī)污染物厭氧發(fā)酵環(huán)境廣泛存在,是厭氧沼氣池中的重要功能菌群。而在pH9的環(huán)境中,該古菌的存在鮮有報(bào)道,是否在原位發(fā)揮功能需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。構(gòu)建湖南沅江麻廠堿性池的元基因組的質(zhì)粒文庫(kù),并保存了19200個(gè)克隆。對(duì)堿性池Fosmid文庫(kù)進(jìn)行活性酶基因的篩選,總計(jì)篩選了7680個(gè)克隆子,共篩選了6種酶：淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶。并對(duì)其做了復(fù)篩,最后的復(fù)篩結(jié)果為：有淀粉酶活性的36個(gè)(強(qiáng)陽(yáng)性4個(gè))、脂肪酶9個(gè)(強(qiáng)陽(yáng)性2個(gè))、蛋白酶4個(gè)(強(qiáng)陽(yáng)性1個(gè))、纖維素4個(gè)(強(qiáng)陽(yáng)性1個(gè))。表明該環(huán)境大分子有機(jī)質(zhì)降解基因含量相對(duì)豐富,并且由于其獨(dú)特的堿性環(huán)境,篩選到的新酶可能同時(shí)具有嗜堿或耐堿的特性,為后續(xù)的工業(yè)應(yīng)用提供了良好的基因資源。從深海熱液區(qū)分離來(lái)源的錳氧化黃氏菌Huangia manganoxydans 8047中克隆了5個(gè)脫鹵酶基因,并成功使其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)。重點(diǎn)分析了DhmB脫鹵酶的生化性質(zhì)：表達(dá)純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶,酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明：DhmB脫鹵酶是一類穩(wěn)定性較強(qiáng)的酶,它的最適反應(yīng)溫度65℃,解鏈溫度為68.8℃,耐受中高溫的影響,在50℃以內(nèi)處理,酶活沒(méi)什么影響,40%二甲基亞砜、30%甲醇、20%的乙醇和乙腈處理,DhmB表現(xiàn)出強(qiáng)的溶劑穩(wěn)定性,能降解低碳鏈的有機(jī)鹵素化合物,能降解經(jīng)典農(nóng)藥(如DTT,六六六等),能降解芥子氣等化學(xué)毒劑。DhmB基因與已報(bào)道的的所有的脫鹵酶基因相似性最高的只有63%(Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1),屬于新基因,錳氧化黃氏菌Huangia manganoxydans8047因其本身來(lái)源于低溫環(huán)境,屬于低溫菌的一類,但是其基因組上脫鹵酶基因表達(dá)的蛋白卻屬于中高溫酶,為我們未來(lái)更深入的研究這類酶提出科學(xué)問(wèn)題,也為未來(lái)使其在工業(yè)應(yīng)用,制藥應(yīng)用,食品安全應(yīng)用中提供更好的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS201.25

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本文編號(hào)：1232909