研究目的:將不同比例的ATDC5細(xì)胞與已被腺病毒轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系,軟骨細(xì)胞為ATDC5提供TGF-β3,評(píng)估這個(gè)共培養(yǎng)體系對(duì)于促進(jìn)ATDC5細(xì)胞向軟骨分化的影響,為其將來(lái)應(yīng)用于軟骨的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:一、細(xì)胞收集、培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞需從新鮮豬軟骨中提取,然后經(jīng)體外培養(yǎng)傳至第三代后凍存?zhèn)溆谩TDC5細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Abgent公司,用ATDC5培養(yǎng)基在150cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。HEK-293細(xì)胞購(gòu)自American type culture collection(ATCC),用HEK-293培養(yǎng)基在75cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。二、擴(kuò)增腺病毒、提純及測(cè)定滴度在之前的研究中已構(gòu)建好了Ad-T,將其轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,然后進(jìn)行提純及測(cè)定滴度。三、構(gòu)建海藻酸鹽水凝膠三維共培養(yǎng)體系將腺病毒轉(zhuǎn)染P4軟骨細(xì)胞,然后按1:1及3:1的比例將ATDC5和軟骨細(xì)胞混合(分別為命名為1A1C及3A1C)。另外再建立兩對(duì)照組(A組),均以單獨(dú)的ATDC5細(xì)胞構(gòu)成,其中一對(duì)照組在培養(yǎng)基中加入外源性的TGF-β3(ArT組)。上述4組細(xì)胞收集后在海藻...

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1軟骨細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果

第一章原代軟骨細(xì)胞的提娶培養(yǎng)及ATDC5細(xì)胞的培養(yǎng)1015mlATDC5培養(yǎng)基（94%F-12培養(yǎng)基，5%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素）。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，每3天換一次培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)融合度達(dá)80-90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，將細(xì)胞擴(kuò)增至足夠數(shù)量后凍存?zhèn)溆谩?、利用光學(xué)顯微鏡....

圖2ATDC5細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文112、ATDC5細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中利用光學(xué)顯微鏡對(duì)其形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察（圖2）。從圖2可見(jiàn)其細(xì)胞呈小圓形，形態(tài)均勻，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)5天融合度可達(dá)80-90%。圖2ATDC5細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果。A為第1天的，見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形；B為第3天，細(xì)胞生長(zhǎng)....

圖3HEK-293細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文15（5）將24孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境下孵育48小時(shí)；（6）熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光數(shù)；用20倍物鏡觀察適合稀釋倍數(shù)的孔中五個(gè)區(qū)域熒光細(xì)胞的數(shù)量，然后計(jì)算熒光細(xì)胞的平均數(shù)（合適的稀釋倍數(shù)為視野內(nèi)約有10%范圍有熒光細(xì)胞，合適區(qū)域?yàn)?...

圖4腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24小時(shí)后

第二章攜帶TGF-β3基因腺病毒的擴(kuò)增、提純及滴度測(cè)定16圖4腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24小時(shí)后。HEK-293細(xì)胞可見(jiàn)到明顯的綠色熒光（比例尺：500μm）。3、腺病毒滴度的測(cè)定提純腺病毒后，測(cè)定其滴度。用腺病毒轉(zhuǎn)染24孔板中的HEK-293細(xì)胞，觀察孔板中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞....

本文編號(hào)：3921073