IBRV 是牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)的病原。該病毒基因組編碼12種糖蛋白,其中糖蛋白gB和糖蛋白gE是該病毒表面囊膜上的重要蛋白。gB基因是病毒復(fù)制所必須的,而gE基因則不是。本研究對IBRVgB、gE基因編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并根據(jù)分析結(jié)果對其抗原區(qū)片段進(jìn)行克隆和原核表達(dá)。結(jié)果顯示:(1)IBRVgB蛋白編碼945aa,在第780-802和809-831位存在跨膜區(qū)域,無信號肽位點,蛋白鏈在300-450位親水性、抗原性、表面可及性較高。IBRVgE蛋白編碼597aa,在第422-444位置存在跨膜區(qū)域,在第28-29位置預(yù)測為存在信號肽剪切位點,蛋白鏈在110-225、450-550位親水性、抗原性、表面可及性較高。(2)擴(kuò)增出gB、gE基因的截短片段,長度分別為279bp和285bp。并成功構(gòu)建了 pET-gB、pET-gE重組表達(dá)質(zhì)粒,重組表達(dá)質(zhì)粒最佳誘導(dǎo)時間為3小時,最佳IPTG濃度為1mmol/L。(3)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gB、pET-gE在宿主表達(dá)菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)后均得到34KDa左右大...

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 病原
        1.1.1 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.1.2 病毒理化特性與生物學(xué)特性
        1.1.3 分子生物學(xué)特性
    1.2 近年來IBR在我國流行情況
    1.3 診斷方法
        1.3.1 包涵體檢查
        1.3.2 病毒分離鑒定
        1.3.3 血清學(xué)診斷
        1.3.4 核酸診斷
    1.4 IBR的防控
    1.5 IBRV的gB、gE糖蛋白研究進(jìn)展
        1.5.1 gB糖蛋白
        1.5.2 gE糖蛋白
    1.6 生物信息學(xué)分析
    1.7 研究的目的及意義
2 IBRV gB、gE基因生物信息學(xué)分析
    2.1 材料
    2.2 方法
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 IBRV gB、gE糖蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果
        2.3.2 IBRV gB、gE糖蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果
        2.3.3 gB、gE糖蛋白細(xì)胞抗原表位參數(shù)預(yù)測結(jié)果
    2.4 討論
3 IBRV截短gB、gE基因截短片段的PCR擴(kuò)增、克隆及鑒定
    3.1 材料
        3.1.1 儀器與設(shè)備
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 載體與菌毒株
        3.1.4 主要溶液的配置
        3.1.5 引物的合成
    3.2 方法
        3.2.1 病毒基因組提取
        3.2.2 對截短片段的PCR擴(kuò)增
        3.2.3 PCR產(chǎn)物電泳
        3.2.4 凝膠回收PCR產(chǎn)物
        3.2.5 連接
        3.2.6 克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 菌落的擴(kuò)增培養(yǎng)
        3.2.8 克隆質(zhì)粒DNA的提取
        3.2.9 pGEM-gB和pGEM-gE的鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 克隆質(zhì)粒pGEM-gB和pGEM-gE PCR鑒定和雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.3 克隆質(zhì)粒pGEM-gB和pGEM-gE測序鑒定結(jié)果
    3.4 討論
4 IBRV截短gB、gE基因的原核表達(dá)及鑒定
    4.1 材料
        4.1.1 儀器與設(shè)配
        4.1.2 載體與菌株
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 主要溶液的配置
    4.2 方法
        4.2.1 克隆質(zhì)粒和pET-32a載體的雙酶切與回收
        4.2.2 截短片段與pET-32a的連接與轉(zhuǎn)化
        4.2.3 pET-gB與pET-gE質(zhì)粒的提取
        4.2.4 pET-gB與pET-gE質(zhì)粒的鑒定
        4.2.5 重組gB和gE蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.6 SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)產(chǎn)物
        4.2.7 免疫印跡鑒定
        4.2.8 最佳誘導(dǎo)時間的優(yōu)化
        4.2.9 最佳IPTG濃度的優(yōu)化
        4.2.10 gE重組蛋白的純化
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 重組質(zhì)粒pET-gB與pET-gE的PCR鑒定及雙酶切鑒定結(jié)果
        4.3.2 重組蛋白可溶性鑒定
        4.3.3 免疫印跡鑒定結(jié)果
        4.3.4 誘導(dǎo)時間優(yōu)化結(jié)果
        4.3.5 IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化結(jié)果
        4.3.6 gE重組蛋白的純化結(jié)果
    4.4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介



本文編號：3844753