生物治理是蘇打鹽堿土治理的有效方法。紫花苜蓿具有較強(qiáng)的抗鹽堿能力,發(fā)掘其抗鹽堿基因并對(duì)其潛在抗性機(jī)理進(jìn)行闡釋,有利于高抗堿性紫花苜蓿新品種的培育和在鹽堿地生物治理中的綜合利用。AP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族是一類(lèi)與鹽堿調(diào)控密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、脅迫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)等諸多功能方面發(fā)揮著重要作用。對(duì)紫花苜蓿中這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的研究,將有助于揭示并闡釋紫花苜蓿的抗鹽堿機(jī)理,提供優(yōu)異的抗鹽堿基因,用于作物的抗鹽堿育種。本研究克隆了紫花苜蓿MsERF003基因。該基因擁有長(zhǎng)度為570bp的開(kāi)放閱讀框,編碼190個(gè)氨基酸殘基。該基因與來(lái)自蒺藜苜蓿MtERF003同源基因同源性為98.84%。通過(guò)qPCR法對(duì)其在碳酸鹽脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)該基因在各個(gè)器官中的表達(dá)量均有上調(diào),在根和莖中上調(diào)尤為明顯。我們構(gòu)建了MtERF003啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入煙草中,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。GUS染色分析表明,該基因的啟動(dòng)子為在煙草中是根特異性表達(dá)啟動(dòng)子,且只在碳酸鹽脅迫下發(fā)揮作用。我們構(gòu)建了過(guò)MsERF003-GFP融合表達(dá)載體,通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析。結(jié)果表明Ms... 

【文章來(lái)源】：長(zhǎng)春師范大學(xué)吉林省

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 鹽堿土及其治理
    1.2 紫花苜蓿及其抗逆性研究
    1.3 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的作用及研究進(jìn)展
第二章 基因和啟動(dòng)子的克隆及分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種與質(zhì)粒
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 抗生素及培養(yǎng)基
    2.2 方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 紫花苜蓿MsERF003基因的克隆
            2.2.2.1 紫花苜蓿組織總RNA的提取及質(zhì)量測(cè)定
            2.2.2.2 紫花苜蓿MsERF003cDNA的合成與載體連接測(cè)序
        2.2.3 MtERF003基因啟動(dòng)子的克隆
            2.2.3.1 蒺藜苜蓿DNA的提取及濃度測(cè)定
            2.2.3.2 啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增與連接測(cè)序
        2.2.4 MsERF003-GFP融合基因的獲得
            2.2.4.1 GFP基因片段的獲得
            2.2.4.2 MsERF003基因與GFP基因的重疊PCR
        2.2.5 紫花苜蓿MsERF003基因生物信息學(xué)分析
        2.2.6 MtERF003基因啟動(dòng)子序列分析
        2.2.7 紫花苜蓿MsERF003基因的表達(dá)模式分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 紫花苜�？俁NA的提取
        2.3.2 基因及啟動(dòng)子的克隆
            2.3.2.1 紫花苜蓿MsERF003基因的克隆
            2.3.2.2 MtERF003基因啟動(dòng)子的克隆
            2.3.2.3 MsERF003-GFP基因的獲得
        2.3.3 基因及啟動(dòng)子的測(cè)序及分析
            2.3.3.1 基因及啟動(dòng)子的測(cè)序及序列比對(duì)
            2.3.3.2 紫花苜蓿MsERF003基因生物信息學(xué)分析
            2.3.3.3 MtERF003基因啟動(dòng)子的序列分析
        2.3.4 紫花苜蓿MsERF003基因表達(dá)模式分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 質(zhì)粒和菌種
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.4 抗生素及培養(yǎng)基
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.2.1 pCAMBIA3301載體大片段的獲取
            3.2.2.2 MsERF003目的基因片段的獲取
            3.2.2.3 目的片段與載體的連接
        3.2.3 啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.3.1 pCAMBIA3301載體大片段的獲取
            3.2.3.2 啟動(dòng)子序列片段的獲取
            3.2.3.3 啟動(dòng)子與載體的連接
        3.2.4 MsERF003-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2.4.1 pCAMBIA3301載體大片段的獲取
            3.2.4.2 MsERF003-GFP基因的獲取
            3.2.4.3 MsERF003-GFP基因與載體的連接
        3.2.5 大腸桿菌菌落PCR鑒定
        3.2.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        3.2.7 煙草遺傳轉(zhuǎn)化
            3.2.7.1 煙草受體材料的準(zhǔn)備
            3.2.7.2 農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備
            3.2.7.3 農(nóng)桿菌侵染
            3.2.7.4 抑菌和恢復(fù)培養(yǎng)
            3.2.7.5 篩選和再生培養(yǎng)
            3.2.7.6 生根培養(yǎng)
            3.2.7.7 煉苗移栽
        3.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
            3.2.8.1 bar基因鑒定（金標(biāo)試紙條鑒定）
            3.2.8.2 PCR檢測(cè)
            3.2.8.3 Southern blot檢測(cè)
        3.2.9 啟動(dòng)子活性分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.1.1 表達(dá)載體pCBC-MsERF003的構(gòu)建
            3.3.1.2 表達(dá)載體　pCBC-MtERF003-QDZ的構(gòu)建
            3.3.1.3 表達(dá)載體pCBC-MsERF003-GFP的構(gòu)建
        3.3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的PCR檢測(cè)
        3.3.3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
            3.3.4.1 bar基因金標(biāo)免疫試紙條檢測(cè)
            3.3.4.2 PCR檢測(cè)
            3.3.4.3 Soutern blot檢測(cè)
        3.3.5 啟動(dòng)子活性分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 MsERF003基因在煙草抗逆中的功能分析
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 抗逆基因檢測(cè)所用引物
    4.2 方法
        4.2.1 MsERF003的亞細(xì)胞定位
        4.2.2 轉(zhuǎn)MsERF003基因煙草植株的碳酸鹽抗性分析
            4.2.2.1 轉(zhuǎn)MsERF003基因煙草的準(zhǔn)備及qPCR分析
            4.2.2.1 脯氨酸含量測(cè)定
            4.2.2.2 丙二醛含量測(cè)定
            4.2.2.3 總糖含量測(cè)定
            4.2.2.4 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）含量測(cè)定
            4.2.2.5 過(guò)氧化氫酶（CAT）含量測(cè)定
            4.2.2.6 過(guò)氧化物酶（POD）含量測(cè)定
            4.2.2.7 K~+/Na~+含量測(cè)定
            4.2.2.8 葉綠素含量測(cè)定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 MsERF003的亞細(xì)胞定位
        4.3.2 轉(zhuǎn)MsERF003基因煙草植株的碳酸鹽抗性分析
            4.3.2.1 轉(zhuǎn)MsERF003基因煙草的碳酸鹽抗性表現(xiàn)
            4.3.2.2 碳酸鹽處理下轉(zhuǎn)MsERF003基因煙草的生理指標(biāo)
            4.3.2.3 抗逆響應(yīng)基因的表達(dá)
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者在攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]紫花苜蓿和燕麥抗鹽堿機(jī)制研究[D]. 高戰(zhàn)武.東北師范大學(xué) 2011

碩士論文
[1]紫花苜蓿抗鹽堿能力綜合評(píng)價(jià)及生理適應(yīng)機(jī)制的研究[D]. 崔祿.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 2014
[2]紫花苜蓿NF-YB3基因的克隆及其耐鹽功能驗(yàn)證[D]. 何平.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3447776