本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌與角叉菜硫代謝基因cysE、cysM和cysC的克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性比較研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：半胱氨酸及非蛋白質(zhì)氨基酸在科研和醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛的用途。半胱氨酸及非蛋白質(zhì)氨基酸酶的生物催化與發(fā)酵生產(chǎn)因其節(jié)能、高效、環(huán)保而越來(lái)越受到重視。本文中克隆了大腸桿菌和海藻角叉菜的硫代謝相關(guān)基因cysE、cysM和cysC;利用在大腸桿菌中高效表達(dá)的同源或異源絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)和O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASS-B),獲得大量活性穩(wěn)定的重組酶(生物催化劑);以各種親核試劑為底物,利用在大腸桿菌中高效重組表達(dá)的重組酶合成非蛋白質(zhì)氨基酸,為下一步通過(guò)多酶體系合成半胱氨酸和含硫非蛋白質(zhì)氨基酸奠定前期工作基礎(chǔ)。本論文首先克隆得到cysE-ECOLI基因,其ORF區(qū)長(zhǎng)822 bp,編碼273個(gè)氨基酸,理論分子量為29.32 kDa,理論等電點(diǎn)為6.05。將cysE-ECOLI基因連接到pET-22b(+)表達(dá)載體上并進(jìn)行原核表達(dá),得到在上清液中重組表達(dá)的可溶性蛋白,經(jīng)純化后,獲得了具有活性的重組蛋白,純化后的酶活性為180 U/mg。為了獲得表達(dá)量更高,催化活性更強(qiáng),更適合大量生產(chǎn)的SAT,本論文首次克隆得到了角叉菜cysE(cysE-CHCR)基因,其ORF區(qū)長(zhǎng)1143 bp,編碼380個(gè)氨基酸,理論分子量為40.60 kDa,理論等電點(diǎn)為6.26。通過(guò)基因克隆及生物信息學(xué)方法對(duì)基因進(jìn)行分析預(yù)測(cè),為下一步重組表達(dá)、活性檢測(cè)等研究奠定基礎(chǔ)。其次,本論文克隆得到大腸桿菌cysM基因,其ORF區(qū)長(zhǎng)912 bp,編碼303個(gè)氨基酸,理論分子量為32.63 kDa,理論等電點(diǎn)為5.42。重組蛋白OASS-B在上清液中以可溶性蛋白形式獲得高效表達(dá),重組蛋白經(jīng)多步純化后獲得高度純化的酶,其活性為728U/mg。重組酶OASS-B與不同濃度的OAS合成了含硫非蛋白質(zhì)氨基酸:β-吡唑丙氨酸(β-PA)和β-三氮唑丙氨酸(β-TA),產(chǎn)物β-PA和β-TA的量與OAS濃度成正相關(guān)。經(jīng)過(guò)抽濾,洗滌,干燥后,產(chǎn)物為白色晶體狀粉末。證明重組表達(dá)的OASS-B能夠通過(guò)改變親核試劑,催化合成不同的含硫非蛋白質(zhì)氨基酸。最后,本論文首次克隆得到角叉菜cysC基因(編碼腺嘌呤-5'-磷酸硫酸激酶,APSK),其ORF區(qū)長(zhǎng)699 bp,編碼232個(gè)氨基酸,理論分子量為25.33 kDa,理論等電點(diǎn)為8.48。對(duì)其氨基酸序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)分析,并對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 角叉菜 絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶 乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶-B 腺嘌呤-5'-磷酸硫酸激酶
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮略語(yǔ)表6-11
• 第1章 引言11-24
• 1.1 硫的吸收與利用11-15
• 1.1.1 硫營(yíng)養(yǎng)的重要性11-12
• 1.1.2 植物對(duì)硫的吸收與運(yùn)輸12-13
• 1.1.3 硫的同化利用13-15
• 1.2 硫代謝相關(guān)基因研究進(jìn)展15-21
• 1.2.1 亞硫酸鹽還原酶15-17
• 1.2.2 CysB蛋白17-19
• 1.2.3 半胱氨酸合成酶19-20
• 1.2.4 APS激酶20-21
• 1.3 硫代謝相關(guān)基因在含硫氨基酸合成中的應(yīng)用21-23
• 1.4 本研究的目的與意義23-24
• 第2章 大腸桿菌、角叉菜cysE基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性24-51
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 菌株與載體24
• 2.1.2 植物材料24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 主要儀器25-26
• 2.2 方法26-38
• 2.2.1 大腸桿菌、角叉菜cysE基因的分子克隆26-34
• 2.2.2 cysE生物信息學(xué)分析34
• 2.2.3 cysE-ECOLI的原核表達(dá)及酶活測(cè)定34-38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-50
• 2.3.1 cysE基因的分子克隆38-40
• 2.3.2 cysE生物信息學(xué)分析40-49
• 2.3.3 cysE-ECOLI基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建49
• 2.3.4 重組SAT的表達(dá)、純化及酶活測(cè)定49-50
• 2.4 討論50-51
• 第3章 大腸桿菌cysM基因的克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性51-62
• 3.1 材料51
• 3.1.1 菌株與載體51
• 3.1.2 主要試劑51
• 3.1.3 主要儀器51
• 3.2 方法51-55
• 3.2.1 cysM基因的分子克隆51-52
• 3.2.2 OASS-B的生物信息學(xué)分析52
• 3.2.3 cysM基因的原核表達(dá)52-55
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-61
• 3.3.1 cysM基因的分子克隆55
• 3.3.2 OASS-B的生物信息學(xué)分析55-58
• 3.3.3 cysM基因的原核表達(dá)58-60
• 3.3.4 OASS-B催化非蛋白質(zhì)氨基酸的合成60-61
• 3.4 討論61-62
• 第4章 角叉菜cysC基因的分子克隆及信息學(xué)分析62-69
• 4.1 材料62
• 4.1.1 菌株與載體62
• 4.1.2 植物材料62
• 4.1.3 主要試劑62
• 4.1.4 主要儀器62
• 4.2 方法62-63
• 4.2.1 角叉菜cysC基因的分子克隆62-63
• 4.2.2 角叉菜cysC基因的生物信息學(xué)分析63
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-68
• 4.3.1 cysC基因的分子克隆63
• 4.3.2 cysC生物信息學(xué)分析63-68
• 4.4 討論68-69
• 全文總結(jié)69-70
• 本文創(chuàng)新點(diǎn)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 附錄A pET-22b(+)質(zhì)粒圖譜76-77
• 附錄B 不同物種SAT的FASTA格式氨基酸序列（Uniprot）77-80
• 附錄C 不同物種APSK的FASTA格式氨基酸序列（Uniprot）80-83
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況83-84
• 致謝84

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 齊冬青;大腸桿菌與角叉菜硫代謝基因cysE、cysM和cysC的克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性比較研究[D];遼寧師范大學(xué);2015年

2 王黛青;結(jié)核分枝桿菌CysE的酶促反應(yīng)特性分析[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌與角叉菜硫代謝基因cysE、cysM和cysC的克隆、表達(dá)及生物學(xué)特性比較研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：344197