發(fā)布時間：2017-05-01 13:02

  本文關(guān)鍵詞：豬環(huán)曲病毒檢測方法的建立及四川省分子流行病學(xué)調(diào)查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬環(huán)曲病毒(Porcine Torovirus, PToV)為一種單股正鏈的RNA病毒,是套式病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae),凸隆病毒屬成員之一。1992年,首次在南非報道的豬腹瀉糞便樣品中分離得到類似BRV病毒的粒子,即豬環(huán)曲病毒。隨后,PToV在荷蘭、西班牙、加拿大、匈牙利、美國和英格蘭等國家被相繼報道。PToV在世界范圍內(nèi)的廣泛分布以及在腹瀉樣品中的高檢出率,使大部分學(xué)者認(rèn)為其極大可能也是一種豬腹瀉的病原。雖然豬環(huán)曲病毒的感染主要引起一些亞臨床癥狀,但它仍然是一種存在潛在威脅的病毒,可能與其它腹瀉病毒共同存在,加重并且惡化感染豬腹瀉病情的發(fā)展情況。由于目前該病毒尚不能被分離純化,在各方面限制了對其的進(jìn)一步研究以及探索。對于該病毒結(jié)構(gòu)和功能、發(fā)病機理、致病性等多方面還存在許多問題尚未得到解決,需要更多進(jìn)一步的研究來闡明其病原特性及生物學(xué)特性。本研究建立了兩種豬環(huán)曲病毒檢測方法,再選擇其中最適合大規(guī)模檢測的方法作為四川地區(qū)豬環(huán)曲病毒流行情況調(diào)查的檢測手段,并對豬環(huán)曲病毒四川株M全基因分子流行病學(xué)特點進(jìn)行分析；根據(jù)GenBank登錄的PToV S基因與N基因序列,利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計合成兩對特異性引物,預(yù)計擴增片段大小為451bp和258bp。隨后,在此基礎(chǔ)上,經(jīng)過相關(guān)一系列的條件優(yōu)化,成功建立了該病毒的RT-PCR以及熒光定量RT-PCR檢測方法。兩種方法的特異性以及重復(fù)性實驗表現(xiàn)較好,兩者的靈敏度分別為10-5和10-。雖然實時熒光定量RT-PCR方法比常規(guī)PCR方法更加靈敏,但經(jīng)過各方面評估后,確定常規(guī)PCR檢測方法更適合作為分子流行病學(xué)調(diào)查的檢測手段。本研究從2011-2013年期間的四川各地區(qū)豬場送檢872份腹瀉豬糞便以及腸道組織的樣品,將這些樣品分為四個類別：1-3周齡,3-7周齡,7-11周齡及超過11周齡豬,利用RT-PCR方法對樣品進(jìn)行檢測,豬環(huán)曲病毒的總陽性率為37.96%(331/872)。再利用RT-PCR擴增豬環(huán)曲病毒M基因序列,通過分子克隆,測序得到19個豬環(huán)曲病毒M基因序列(GenBank登錄號：KF727566-KF727584.),核苷酸序列相似性為97.3-99.9%,氨基酸序列相似性為99.1-99.6%。利用序列分析軟件MEGA 5.0對豬環(huán)曲病毒M基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示本研究獲得的四川株豬環(huán)曲病毒與兩株韓國株分屬于一個大的分支,說明了豬環(huán)曲病毒M基因序列的高度保守性。其與韓國株在進(jìn)化上比較接近,又說明目前我國PToV的流行毒株比較穩(wěn)定,沒有發(fā)生大的基因變異。
【關(guān)鍵詞】：豬環(huán)曲病毒 RT-PCR 熒光定量RT-PCR 分子流行病學(xué)調(diào)查
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 常用縮略詞表8-13
• 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1 PToV的發(fā)現(xiàn)13-15
• 2 PToV基因組結(jié)構(gòu)及特點15-17
• 3 PToV生物學(xué)特性17
• 4 PToV檢測方法17-18
• 5 PToV流行病學(xué)18-19
• 6 前景展望19-21
• 第一章 豬環(huán)曲病毒檢測方法的建立21-39
• 1 實驗材料21-23
• 1.1 病毒與細(xì)菌21
• 1.2 臨床樣品21-22
• 1.3 主要試劑和儀器22
• 1.4 溶液配制22-23
• 2 實驗方法23-28
• 2.1 豬環(huán)曲病毒RT-PCR檢測方法的建立23-26
• 2.1.1 引物設(shè)計與合成23
• 2.1.2 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄23
• 2.1.3 PCR擴增23-24
• 2.1.4 RT-PCR產(chǎn)物的回收24
• 2.1.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備24-25
• 2.1.6 目的片段的克隆25
• 2.1.7 目的片段的測序25-26
• 2.1.8 特異性實驗26
• 2.1.9 敏感性實驗26
• 2.1.10 重復(fù)性實驗26
• 2.1.11 臨床樣品檢測26
• 2.2 豬環(huán)曲病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立26-28
• 2.2.1. 病毒核酸的提取26
• 2.2.2 熒光定量引物設(shè)計26-27
• 2.2.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備27
• 2.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化27
• 2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立27-28
• 2.2.6 特異性檢測28
• 2.2.7 可重復(fù)性及再現(xiàn)性評估28
• 2.2.8 實時熒光RT-PCR和已建立常規(guī)的PCR靈敏度比較28
• 2.2.9 建立實時熒光RT-PCR對臨床樣品的檢測28
• 2.2.10 實時熒光RT-PCR與已建立常規(guī)的PCR選擇28
• 3 結(jié)果28-35
• 3.1 豬環(huán)曲病毒RT-PCR檢測方法結(jié)果28-32
• 3.1.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果28-29
• 3.1.2 目的片段克隆測序與序列分析29
• 3.1.3 特異性實驗結(jié)果29-30
• 3.1.4 敏感性實驗結(jié)果30-31
• 3.1.5 重復(fù)性實驗結(jié)果31
• 3.1.6 臨床樣品檢測結(jié)果31-32
• 3.2 豬環(huán)曲病毒熒光定量RT-PCR檢測方法結(jié)果32-35
• 3.2.1 優(yōu)化的Real Time RT-PCR檢測條件32
• 3.2.2 PToV實時熒光RT-PCR敏感性32-33
• 3.2.3 Real Time RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線33-34
• 3.2.4 融解曲線和特異性分析34
• 3.2.5 重復(fù)性與再現(xiàn)性34-35
• 3.2.6 建立的RRT-PCR方法對臨床樣品的檢測35
• 3.2.7 實時熒光RT-PCR與已建立常規(guī)的PCR的選擇35
• 4 討論35-38
• 4.1 RT-PCR檢測方法35-36
• 4.2 RRT-PCR檢測方法36-38
• 5 小結(jié)38-39
• 第二章 四川省2011-2013年豬環(huán)曲病毒流行病學(xué)調(diào)查39-54
• 1 實驗材料39
• 1.1 樣品收集及分類39
• 2 實驗方法39-42
• 2.1 引物設(shè)計與合成39-40
• 2.2 RNA的提取及RT-PCR的擴增40-41
• 2.3 PToV M基因的擴增,克隆及測序41-42
• 2.4 PToV M基因的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制42
• 3 結(jié)果42-51
• 3.1 PToV采集區(qū)域圖42
• 3.2 不同豬群PToV感染率42-43
• 3.3 不同地區(qū)PToV感染率43-44
• 3.4 混合感染檢測結(jié)果44-45
• 3.5 進(jìn)化樹的建立45-47
• 3.6 M基因的同源性比對47-50
• 3.7 基因突變分析50-51
• 4 討論51-53
• 4.1 流行病學(xué)51-52
• 4.2 進(jìn)化分析52-53
• 5. 小結(jié)53-54
• 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王峗;周璐;周遠(yuǎn)成;蔡雨函;朱玲;徐志文;郭萬柱;;豬環(huán)曲病毒套式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年07期

2 ;[J];;年期

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1 周璐;豬環(huán)曲病毒檢測方法的建立及四川省分子流行病學(xué)調(diào)查[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 顧凡;豬嵴病毒、豬星狀病毒和豬環(huán)曲病毒的多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號：338929