本文關(guān)鍵詞：嗜瓊膠卵鏈菌比較基因組學(xué)研究及系列瓊膠酶基因的克隆表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：海洋碳源類(lèi)型多樣,碳循環(huán)途徑復(fù)雜,海洋微生物參與到各個(gè)碳循環(huán)途徑中,在海洋碳循環(huán)過(guò)程中起到重要作用,并針對(duì)不同碳源的降解利用進(jìn)化出不同的代謝類(lèi)型。新屬新種嗜瓊膠卵鏈菌YMO1T (Catenovulum agarivorans YM01T)屬于γ-變形菌綱交替單胞菌科,分離自中國(guó)黃海青島太平角海域采集表層海水樣品,能夠降解包括瓊膠、吐溫80和七葉靈在內(nèi)的大分子碳水化合物,其中對(duì)瓊膠的降解能力較強(qiáng),能夠產(chǎn)生高耐熱性的瓊膠酶。在對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn),菌株YM01T的基因組中包含15個(gè)可能的瓊膠酶基因。為了了解YM01T的碳水化合物降解能力,研究海洋微生物在海洋碳循環(huán)中所起的重要作用,我們對(duì)該菌株的基因組序列進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。菌株YM01T的基因組大小為5,025,099 bp,利用Glimmer3.0軟件共預(yù)測(cè)得到4,215個(gè)基因、54個(gè)tRNA。選取交替單胞菌科中5株典型的瓊膠降解菌株與菌株YM01T基因組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),6個(gè)基因組中共有860個(gè)同源基因簇,占YM01T基因總數(shù)的23.89%,與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化(J)相關(guān)的基因在6個(gè)基因組的同源基因中所占比例最高,達(dá)到3.18%。菌株YM01T中共有892個(gè)特有基因簇,占全基因組的9.24%。其中占比例最高的是預(yù)測(cè)的一般功能性基因(R,1.22%),其次是碳水化合物的運(yùn)輸和代謝(G,1.15%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因(T,0.96%)。對(duì)6株細(xì)菌的碳水化合物利用相關(guān)基因進(jìn)行進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn),同屬于嗜瓊膠卵鏈菌屬的菌株YM01T和DS2的全基因組中所含的碳水化合物利用相關(guān)基因的數(shù)目分別為447個(gè)和674個(gè),聚類(lèi)到76個(gè)糖苷水解酶家族中,占各自基因組的比例分別為10.70%和17.12%,在6個(gè)基因組中比例最高。與此同時(shí),菌株YM01T和DS2在降解利用淀粉、纖維素、結(jié)冷膠、瓊膠、果膠和木葡聚糖等大分子碳水化合物方面具有明顯的基因優(yōu)勢(shì)。其中,YM01T中預(yù)測(cè)得到18個(gè)與瓊膠降解相關(guān)的酶,包括13個(gè)β-瓊膠酶、2個(gè)α-瓊膠酶和3個(gè)α-新瓊二糖水解酶；DS2中含有30個(gè)瓊膠降解相關(guān)基因,包括17個(gè)p-瓊膠酶基因,1個(gè)α-瓊膠酶基因和12個(gè)α-新瓊二糖水解酶。兩者中瓊膠降解相關(guān)基因的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他4個(gè)基因組,并且含有α-瓊膠酶降解通路,暗示了YM01T和DS2強(qiáng)烈的瓊膠降解能力。除此以外,菌株YM01T的基因組中包含63個(gè)趨化性相關(guān)基因,它們分別與信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo),應(yīng)激性,適應(yīng)性和信號(hào)轉(zhuǎn)移功能相關(guān),這暗示了菌株YM01T可以更快地對(duì)刺激做出反應(yīng),以便適應(yīng)復(fù)雜多變的海洋環(huán)境。對(duì)菌株YM01T中的10個(gè)瓊膠酶基因進(jìn)行重組表達(dá),獲得了3個(gè)有活性的瓊膠酶蛋白。其中YM01-1和YM01-5的理論分子量分別為37.8 kDa和91.6 kDa,等電點(diǎn)分別為4.66和5.31。對(duì)YM01-5進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為37℃,最適反應(yīng)pH為9.0,在0-37℃放置30 min能夠保持80%以上的酶活力,pH 6-10之間保持較高的穩(wěn)定性,在該范圍的pH緩沖液中放置12h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。測(cè)得的YM01-5的Km值和Vmax值分別為222.2 mg/ml,20.8U/mg。SDS、Ni2+對(duì)重組瓊膠酶YM01-5有很強(qiáng)的抑制作用,而Mg2+和Fe3+對(duì)YM01-5的活性具有促進(jìn)作用,且隨著濃度升高促進(jìn)作用更加明顯。YM01-5以外切酶的形式作用于瓊脂糖分子,產(chǎn)生唯一的降解產(chǎn)物新瓊二糖。
【關(guān)鍵詞】：嗜瓊膠卵鏈菌YM01~T 全基因組比較分析 碳水化合物活性酶 趨化性 瓊膠酶 重組表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q93;Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-28
• 1 微生物基因組研究進(jìn)展11-16
• 1.1 微生物基因組研究概述11-12
• 1.2 細(xì)菌基因組的分析比較12-15
• 1.3 微生物全基因組的研究意義15-16
• 2 海洋微生物對(duì)碳源的降解利用16-20
• 2.1 海洋微生物降解碳源的類(lèi)型16-19
• 2.2 研究微生物降解利用碳源的意義19-20
• 3 瓊膠的降解利用20-26
• 3.1 瓊膠酶的來(lái)源,分類(lèi)20-26
• 3.2 瓊膠酶的作用26
• 4 本論文的研究目的和意義26-28
• 第二章 嗜瓊膠卵鏈菌YM01~T的比較基因組分析28-48
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器28-30
• 1.1 菌株28
• 1.2 試劑與培養(yǎng)基28-29
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器29-30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-31
• 2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)30
• 2.2 菌株YM01~T全基因組測(cè)序及組裝30
• 2.3 基因組組分分析及基因功能預(yù)測(cè)30
• 2.4 全基因組的比較分析30-31
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析31-45
• 3.1 菌株YM01~T基因組DNA的提取與檢測(cè)31-32
• 3.2 菌株YM01~T基因組的一般特性32-33
• 3.3 菌株YM01~T的比較基因組分析33-39
• 3.4 碳水化合物利用相關(guān)基因的分析39-44
• 3.5 趨化性基因的數(shù)量和分布44-45
• 4 討論45-47
• 5 小結(jié)47-48
• 第三章 系列瓊膠酶基因的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究48-77
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器48-52
• 1.1 菌株和質(zhì)粒48-51
• 1.2 試劑與培養(yǎng)基51
• 1.3 主要儀器51-52
• 2 實(shí)驗(yàn)方法52-61
• 2.1 瓊膠酶基因結(jié)構(gòu)分析52
• 2.2 系列瓊膠酶基因的克隆表達(dá)52-56
• 2.3 重組瓊膠酶的純化56-57
• 2.4 重組瓊膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究57-61
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析61-74
• 3.1 瓊膠酶基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果61-68
• 3.2 瓊膠酶基因的表達(dá)結(jié)果和酶活性檢測(cè)68-69
• 3.3 重組瓊膠酶的純化及蛋白含量檢測(cè)69-70
• 3.4 重組瓊膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究70-74
• 4 討論74-76
• 5 小結(jié)76-77
• 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 附錄85-87
• 致謝87-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷88
• 科研成果88

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本文編號(hào)：322894