甾體類藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物,具有重要的生理活性,在臨床上有廣泛的應(yīng)用。許多分枝桿菌可以使用低附加值的甾醇作為碳源和能源來生產(chǎn)甾體激素藥物成分或前體,因此,修飾或改造分枝桿菌代謝途徑以積累高附加值甾體中間體是甾體制藥工業(yè)半合成路線中最重要的一步。甾醇氧化過程在分枝桿菌中高度保守,通過對甾體多環(huán)或側(cè)鏈的一些生物轉(zhuǎn)化,可以得到許多有價值的藥物中間體,如C19類固醇雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）、9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）以及C22類固醇20-羥甲基孕甾-4-烯-3-酮（4-HBC）。本論文利用一系列基因編輯技術(shù)改造實驗室現(xiàn)有菌種,獲得可以大量積累AD和9α-OH-AD的工程菌。首先利用CRISPR-dCas9構(gòu)建了抑制Mn-AD中hsd4A表達的菌株,同時抑制Mycobacterium neoaurum 2967（M.neoaurum 2967）中hsd4A 和kstD表達的菌株,以及利用CRISPR-Cas12a構(gòu)建了恥垢分枝桿菌mc2155（M.smegmatis mc2155）中kstD1的... 

【文章來源】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：94 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２部分甾體藥物中間體的結(jié)構(gòu)??１．１．４甾醇及甾醇代謝的分子機制??

?甾酮－４－烯結(jié)構(gòu)之后由細胞色素Ｐ４５０?（ｃｙｐｌ２５或／和ｃｙｐｌ４２）催化側(cè)鏈末端氧??化，生成末端帶有輕基或竣基的物質(zhì)，再經(jīng)甾醇輔酶Ａ連接酶（ｓｔｅｒｏｌ－ＣｏＡｌｉｇａｓｅｓ）、??脫氫酶（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）、水合酶（ｈｙｄｒａｔａｓｅｓ）以及酰基輔酶Ａ硫解酶（ａｃｙｌ－??ＣｏＡｔｈｉｏｌａｓｅｓ）催化后，脫去一分子丙酰輔酶Ａ生成一種Ｃ２４羧酸物質(zhì)。經(jīng)過三??輪類似的Ｐ－氧化留醇側(cè)鏈完全降解，產(chǎn)生ＡＤ中間體以及一個乙酰輔酶Ａ和兩??個丙酰輔酶Ａ分子［２４１?（圖１．３）。??＇廣八，ｃｈ２ｏｈ??ｒ?斗、、?Ｃ］＇＇??丫?３Ｐ－ＨＳＤ?Ｃｙｐ１２５／Ｃｙｐ１４２?，，、｜．－丄＇＇，丄－－’＇??Ｈｃｊ’、＇＇入’?ＣｈＯｘ?、夕、」??Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ?２６－ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ??Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ??，ｒｔ＞ｌ??。切?－Ｄ。．以Ｊ?＾??〇政１??９－ＯＨ－ＡＤＤ?ＡＤ??Ｃｈｏｌｅｓｔ－４－ｅｎ－３－ｏｎｅ－２６－ｏｉｃ?ａｃｉｄ??Ｎｏ?ｅｎｚｙｍａｔｉｃ??。冰?ｘ６?ｒ＇Ｈ??ＨｓａＡＢ?ＦａｄＤ３?〇?—??ｒ?二?ｃ〇２＋ｈ２〇??Ｈ〇ｘｒ?人＾??３－ＨＳＡ?ＨＩＰ?ＨＩＰ－ＣｏＡ??圖１．３膽固醇可能的降解途徑??４??

氫反應(yīng)生產(chǎn)氫化潑尼龍等具有抗炎作用的腎上??腺皮質(zhì)激素和高附加值的留體藥物［７］。利用化學(xué)方法也能進行２位的脫氫反應(yīng)，??但化學(xué)法通常有產(chǎn)物毒性大、環(huán)境污染等缺點，微生物轉(zhuǎn)化則能較好地取長補短，??在甾體抗炎激素類藥物合成中扮演著重要的角色。??２．?３－甾酮－Ａ１－脫氫酶??甾酮?Ｃｉ，２?位脫氫酶，也稱?３－甾酮－Ａ１－脫氫酶Ｇ－ｋｅｔｏｓｔｅｒｏｉｄ－Ａ＾ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，??ＫｓｔＤ），是甾體母核降解的關(guān)鍵酶，能催化３－甾酮化合物在甾體母核Ａ環(huán)的ＣＵ??位處脫氫（圖１．４）。不同微生物中的３－留酮－Ａ１－脫氫酶并不完全相同［４（ｙｌ，不同菌??種來源的３－留酮－Ａ１－脫氫酶也有很多相似性［７］。??．〇?．?，０??＋．々?ＫｓｔＤ?ｒ，＇．＇４－??ｒ十．丄丫上？，?＾??？人＾＾?０人入」??ＡＴ）?ＡＤＤ??圖１．４甾體化合物位脫氫基本反應(yīng)式??５??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]新一代精準(zhǔn)基因編輯工具CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)勢與應(yīng)用局限[J]. 吳言,郝雅蕎,韋璇,沈琦,柳葉飛,王升厚,趙洪新.  生物技術(shù)通報. 2018(05)
[2]基因組編輯工具的新晉“黑馬”:FnCpf1在人類細胞內(nèi)具備有效基因組編輯活性[J]. 谷峰.  遺傳. 2017(10)
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博士論文
[1]分枝桿菌甾醇代謝機制的解析以及其代謝工程改造應(yīng)用于制備重要甾藥中間體的研究[D]. 姚抗.華東理工大學(xué) 2014
[2]Mycobacterium neoaurum NwIB-01降解甾醇母核關(guān)鍵酶3-甾酮-△1-脫氫酶和3-甾酮-9α-羥化酶基因的鑒定及其基因工程改造[D]. 魏巍.華東理工大學(xué) 2010

碩士論文
[1]分枝菌酸缺失對谷氨酸棒桿菌ATCC13869的影響研究[D]. 高云飛.江南大學(xué) 2018
[2]谷氨酸棒桿菌分枝菌酸的提取、純化及結(jié)構(gòu)分析[D]. 楊揚.江南大學(xué) 2012
[3]轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄甾烯酮菌株的篩選鑒定及發(fā)酵工藝的研究[D]. 廖偉宏.江南大學(xué) 2008
[4]分枝桿菌分枝菌酸的反相高效液相色譜分型鑒定技術(shù)方法研究[D]. 杜蓉.廣東藥學(xué)院 2008



本文編號：2913386