木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源,目前,我國每年產(chǎn)生約有6億廢棄木材和農(nóng)作物秸稈,但是人們通常用焚燒的方式處理秸稈,不能被有效利用起來,這種方式不僅浪費了資源,加重了環(huán)境污染,增加大氣中二氧化碳的含量使溫室效應加劇。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可以被用熱化學處理法來除去木質(zhì)素,使半纖維素和纖維素組分松散,木質(zhì)纖維素可以被各種纖維素水解酶分解,產(chǎn)生單體糖,然后將其發(fā)酵成乙醇。在植物細胞壁中,半纖維素與木質(zhì)素以共價鍵連接,纖維素內(nèi)包含著微纖絲核心,外部包圍著半纖維素形成的基質(zhì)層,這種結(jié)構(gòu)進一步阻礙了纖維素分解酶和半纖維素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木質(zhì)纖維素是我們目前面臨的重大難題。嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）是一類可在高溫環(huán)境中生存的真菌,在40⁵0℃的條件下生長繁殖,從嗜熱真菌中分離的熱穩(wěn)定酶,在未來的工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應用前景。多糖單加氧酶（Polysaccharide monooxygenases,PMOs）是一類含銅氧化酶,在還原型輔因子（如維生素C）存在下可使纖維素分子氧化降解。本研究以嗜熱子囊菌為材料,提取真菌菌... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 纖維素酶概況
        1.1.1 纖維素酶組成
        1.1.2 纖維素酶的酶促水解
    1.2 多糖單加氧酶（PMO）簡述
        1.2.1 多糖單加氧酶（PMO）的研究過程
        1.2.2 多糖單加氧酶（PMO）的分類機制
        1.2.3 多糖單加氧酶（PMO）的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.4 多糖單加氧酶（PMO）的協(xié)同作用
    1.3 嗜熱真菌的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 嗜熱真菌研究意義
        1.3.2 嗜熱真菌的分子生物學應用
    1.4 嗜熱子囊菌PMO的獲得及應用
        1.4.1 嗜熱子囊菌PMO基因的篩選與獲得
        1.4.2 嗜熱子囊菌PMO酵母工程菌的構(gòu)建
        1.4.3 嗜熱子囊菌PMO異源表達最適條件研究
        1.4.4 嗜熱子囊菌PMO酶解效率研究
        1.4.5 嗜熱真菌PMO酶制劑的應用分析
    1.5 選題意義以及研究內(nèi)容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 實驗試劑盒
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 數(shù)據(jù)處理軟件
        2.1.5 培養(yǎng)基的制備
        2.1.6 溶液的制備
    2.2 嗜熱子囊菌PMO片段的克隆及其序列分析
        2.2.1 嗜熱子囊菌DNA的提取
        2.2.2 DNA樣品檢測
        2.2.3 擴增PMOs基因
            2.2.3.1 PCR引物設計
            2.2.3.2 PCR擴增
            2.2.3.3 PCR產(chǎn)物膠回收
        2.2.4 克隆載體的連接轉(zhuǎn)化
        2.2.5 重組質(zhì)粒的DNA提取
    2.3 PMOs基因在畢赤酵母中的克隆表達及分離純化
        2.3.1 表達載體pPICZαA的構(gòu)建
        2.3.2 質(zhì)粒的線性化及去磷酸化
        2.3.3 酵母轉(zhuǎn)化（電擊法）
            2.3.3.1 P.pastoris GS115感受態(tài)細胞的制備
            2.3.3.2 重組表達質(zhì)粒pPICZαA-PMO的電擊轉(zhuǎn)化
        2.3.4 二次篩選并鑒定酵母陽性轉(zhuǎn)化子
        2.3.5 重組表達質(zhì)粒工程菌的培養(yǎng)以及多糖單加氧酶的誘導表達
        2.3.6 重組多糖單加氧酶的分離與純化
            2.3.6.1 硫酸銨沉淀
            2.3.6.2 HisTrapTM FF鎳柱親和層析
        2.3.7 蛋白質(zhì)分子量及其純度鑒定
            2.3.7.1 蛋白質(zhì)濃度測定
            2.3.7.2 蛋白質(zhì)純度測定
            2.3.7.3 多糖單加氧酶氨基酸序列分析
    2.4 PMOs蛋白的酶學特性研究
        2.4.1 PMO的最適反應溫度
        2.4.2 PMO的最適反應pH值
        2.4.3 PMO蛋白與纖維素酶的協(xié)同作用
    2.5 多糖單加氧酶產(chǎn)物的TLC分析
        2.5.1 薄層層析法（TLC）分析產(chǎn)物
        2.5.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（TOF）分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 嗜熱子囊菌PMO蛋白的序列分析及片段克隆
        3.1.1 嗜熱子囊菌兩個PMOs的序列分析
        3.1.2 嗜熱子囊菌PMO基因的擴增與鑒定
    3.2 PMOs基因在畢赤酵母中的克隆表達及分離純化
        3.2.1 表達載體pPICZαA-PMO的構(gòu)建
        3.2.2 表達載體pPICZαA-PMOs的克隆
        3.2.3 表達載體pPICZαA-PMOs的酵母轉(zhuǎn)化以及抗性篩選
        3.2.4 鑒定酵母陽性轉(zhuǎn)化子
        3.2.5 重組多糖單加氧酶的表達
        3.2.6 重組多糖單加氧酶的純化
        3.2.7 重組多糖單加氧酶的分子量及純度測定
    3.3 嗜熱子囊菌PMOs的性質(zhì)研究
        3.3.1 PMOs的TLC產(chǎn)物分析
        3.3.2 最適反應溫度
        3.3.3 PMO的最適反應pH值
        3.3.4 PMO的飛行時間質(zhì)譜分析
        3.3.5 PMO的協(xié)同作用分析
4 討論
    4.1 嗜熱子囊菌PMO蛋白的序列分析及片段克隆
        4.1.1 嗜熱子囊菌兩個PMOs的序列分析
        4.1.2 嗜熱子囊菌PMOs基因的表達載體構(gòu)建
        4.1.3 嗜熱子囊菌重組PMO的異源表達
            4.1.3.1 重組質(zhì)粒的線性化
            4.1.3.2 重組質(zhì)粒的高效異源表達
    4.2 嗜熱子囊菌重組PMO的性質(zhì)探究
        4.2.1 嗜熱子囊菌重組PMO的氧化裂解性
        4.2.2 嗜熱子囊菌重組PMO的酶促活性
5 結(jié)論
    5.1 嗜熱子囊菌PMO的克隆表達以及分離純化
    5.2 多糖單加氧酶酶解產(chǎn)物及協(xié)同作用分析
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)高密度發(fā)酵研究進展[J]. 閔兆升,郭會明,顏旭,洪厚勝.  生物技術(shù)通報. 2014(03)
[2]纖維素酶的分子生物學與基因工程研究進展[J]. 劉燕,張宏福,孫哲.  飼料工業(yè). 2007(18)
[3]巴斯德畢赤酵母外源基因表達系統(tǒng)[J]. 李健仔.  生物學通報. 2005(03)
[4]嗜熱真菌M5的生物學特性[J]. 姜成,龐俊成,鄭淵明,王澤生.  中國食用菌. 1996(04)
[5]生物增溫發(fā)酵劑中TM1產(chǎn)生的幾種酶的特點[J]. 凌霞芬,馮志勇.  食用菌. 1994(03)



本文編號：2906799