牛傳染性鼻氣管炎病毒（Bovine Infectious Rhinotracheitis Virus,IBRV）又稱為是BoHV-1,是牛傳染性鼻氣管炎（Bovine Infectious Rhinotracheitis,IBR）的病原體,也是引起牛呼吸道疾病的重要病毒性病原之一。BoHV-1感染除引起呼吸道炎癥外,還可引起結(jié)膜炎、流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等。此外,BoHV-1具有三叉神經(jīng)節(jié)潛伏感染周期性激活的特點,導(dǎo)致牛傳染病鼻氣管炎（IBR）清除難度較大,影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展。目前國內(nèi)傳統(tǒng)的商品化疫苗具有潛在的風險,所以研制出新型疫苗及抗體診斷制劑,對IBR的防治具有積極的意義。本研究對BoHV-1 Barthanu/67株進行超速離心濃縮作為免疫原,腹腔免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,采用間接免疫熒光方法篩選獲得2株單克隆抗體并制備腹水,分別命名為3C1和4F3。亞類鑒定2株單抗重鏈分別為IgGl和IgA,輕鏈均為kappa鏈;間接免疫熒光方法測定上清及腹水效價,單抗3C1效價分別為1:40和1:12 800,單抗4F3效價分別為1:40和1:3200;經(jīng)間接免疫熒光和Western blot... 

【文章來源】： 賈曉雪 黑龍江八一農(nóng)墾大學

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

BoHV-1蛋白結(jié)構(gòu)(EricB,1996)

抗BoHV-1單克隆抗體的制備及鑒定212.2.6.2MAb中和活性的測定DMEM將單抗從1:100倍稀釋，連續(xù)2倍稀釋的3C1細胞培養(yǎng)上清與100個TCID50的BoHV-1病毒混合，于37℃水浴鍋作用1h，將混合液每孔100μL接種到96孔板內(nèi)鋪滿單層的MDBK細胞上孵育，將只含100個TCID50/100μL病毒混合液直接鋪于MDBK細胞內(nèi)設(shè)為陽性對照和并將DMEM培養(yǎng)基不含單抗上清及接種病毒發(fā)細胞設(shè)為陰性對照照，于48h后觀察細胞病變，逐日觀察，120h后判定結(jié)果，在倒置顯微鏡下觀察細胞病變并作好記錄，按Reed–Muench兩氏法計算中和效價。2.2.7單克隆抗體的交叉保護分析取本實驗室分離并保存保存的以BVDV、BRV、和PRV進行Westernblot分析，將對所獲得的單克隆抗體交叉反應(yīng)進行分析。2.3實驗結(jié)果及分析2.3.1免疫原的鑒定取經(jīng)超離濃縮的BoHV-1稀釋后與未感染MDBK的細胞培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE電泳，以實驗室制備出的分離制備的BoHV-1牛陽性血清為一抗，以HRP-IgG標記的兔抗�？贵w為二抗進行Westernblot鑒定。結(jié)果顯示，BoHV-1牛陽性血清可與超離濃縮的BoHV-1于相對分子質(zhì)量約55KDa處可見明顯特異性結(jié)合條帶，因抗牛血清為多抗，當能與BoHV-1全病毒有明顯反應(yīng)條帶時即可證明我們制備的免疫原反應(yīng)原性良好。見圖2.1。圖2.1免疫原的鑒定M：Marker；1：BoHV-1超離濃縮病毒；2：未感染BoHV-1的MDBK細胞Fig.2.1.Identificationofimmunogen1:BoHV-1ultra-isolatedvirus;2:MDBKcellsnotinfectedwithBoHV-1

抗BoHV-1單克隆抗體制備及gD蛋白抗原表位鑒定222.3.2單克隆抗體的制備2.3.2.1雜交瘤細胞的融合細胞融合后，融合后7-10天時，鏡下觀察，可見明顯的細胞團見圖2.2。圖2.2融合細胞團Fig.2.2FusionCellCluster2.3.2.2雜交瘤細胞株的篩選篩選到的陽性雜交瘤細胞孔內(nèi)有且僅有一個細胞團時，經(jīng)6次亞克隆，通過IFA篩選最終獲得陽性雜交瘤細胞2株單克隆抗體，分別命名為3C1、4F3。見圖2.3。圖2.3單克隆抗體的熒光分析（200μm）A：單克隆抗體3C1；B：單克隆抗體4F3；C：BoHV-1未感染的MDBK細胞Fig.2.3Fluorescenceanalysisofmonoclonalantibodies(200μm)A:Monoclonalantibody3C1;B:Monoclonalantibody4F3;C:BoHV-1uninfectedMDBKcells2.3.3單克隆抗體的生物學特性分析2.3.3.1亞類鑒定單克隆抗體3C1、4F3根據(jù)Biodragon小鼠單抗亞類鑒定的試劑盒說明書操作進行亞類和輕鏈進行了鑒定，結(jié)果顯示3C1重鏈為IgG1亞類，輕鏈為Kappa鏈;4F3為IgA亞類，輕鏈為Kappa鏈。如圖2.4所示。圖2.4單克隆抗體的亞類鑒定Fig.2.4Identificationofsubclassesofmonoclonalantibodies

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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