本文選題：枯草芽孢桿菌　切入點：生物活性　出處：《江蘇大學》2017年碩士論文

【摘要】：工業(yè)酶是使用生物催化方法生產(chǎn)食品、醫(yī)藥、化工等產(chǎn)品的主要酶源。它們具有手性、立體異構(gòu)和結(jié)構(gòu)域特異性,并且具有在簡單介質(zhì)(如水)中而不是特定介質(zhì)(如有機溶劑和其他溶液)中識別底物的能力。脂肪酶是α或β折疊水解酶,也是眾所周知的蛋白拆分器。來自嗜熱生物的脂肪酶能耐受高溫,可用于工業(yè)生物過程。而且,這些酶的穩(wěn)定性和表達可以通過將其展示在芽孢表面上來改善。芽孢展示技術(shù)效果顯著,低成本,耗時少,因此是很有潛力的技術(shù),可應用于環(huán)境、醫(yī)療和工業(yè)等行業(yè)中。芽孢能耐受惡劣的工業(yè)環(huán)境,包括耐熱、耐堿、耐化學溶劑,易于回收和可再利用,因此芽孢展示技術(shù)工業(yè)中應用前景廣泛。酵母菌和細菌(包括革蘭氏陽性和陰性菌),是最常被用于展示各種蛋白質(zhì)的載體,但與孢子不同,由于營養(yǎng)細胞對熱、p H和化學物質(zhì)敏感,易破裂。因此,芽孢是避免這些問題的最佳選擇,并且相對于營養(yǎng)細胞展示技術(shù),芽孢展示技術(shù)則具有多種應用領域。梭菌和芽孢桿菌的各種菌株都能形成芽孢,但是枯草芽孢桿菌最合適做展示載體,因為根據(jù)世衛(wèi)組織認定它對人類是安全的,被認為是“GRAS”(通常被認為是安全的)。芽孢表面展示技術(shù)在工業(yè)、疫苗開發(fā)、環(huán)境等方面有著各種應用,細胞表面展示增強了蛋白質(zhì)表達穩(wěn)定性和活性,合適的連接肽會使展示的融合蛋白活性和穩(wěn)定性增強。在本研究中,以海棲熱袍菌和枯草芽孢桿菌染色體基因組作為模板進行PCR擴增脂肪酶Tm1350和Cot B基因,在Tm1350和Cot B之間融合了一系列具有不同長度、剛?cè)嵝院蜌埢恢玫倪B接肽基因,將所需基因插入大腸桿菌B.subtilis穿梭載體PHS,構(gòu)建了重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒PHS-Cot B-LxTm1350轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中并誘導芽孢形成。純化芽孢,通過western印跡分析證實了Cot B-Lx-Tm1350的表達。檢測了各種溫度(40-80℃),不同p H(范圍4.0-10)和不同有機溶劑對含各種連接肽的芽孢表面展示酶生物活性的影響。結(jié)果表明所有芽孢展示的融合蛋白的最適溫度為75℃,L8和L10的最適p H為8.5,對于L0,L5,L6和L9,最適p H為9.0,而對于L1,L2,L3,L4和L7最適p H為9.5。在最佳溫度和p H下,具有較長柔性連接肽L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)和L7(GGGGS-GGGGS-EAAAK-EAAAK-GGGGS-GGGGS)的融合蛋白具有比原始活性高1.29和1.16倍的活性。此外,在80℃下,孵育5小時后,具有連接肽L3(EAAAKGGGGS)和L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)的展示酶熱穩(wěn)定性最好,分別比原來的活性高1.40和1.35倍。測定了不同氨基酸殘基位置取向和長度的連接肽的展示酶生物活性,其中L5,L6和L7含有30個不同氨基酸殘基取向的連接肽的測定結(jié)果表明L7展示酶的活性分別是L6和L5的1.05和1.27倍。研究了0.1%蛋白酶K和菠蘿蛋白酶,20%乙醇和30%甲醇對含連接肽的重組芽孢活性的影響。具有適當甘氨酸殘基(柔性)的連接肽展示比丙氨酸殘基(剛性)具有更高的活性。綜上所述,為了提高工業(yè)過程中展示酶的活性和穩(wěn)定性,通過在一定程度上優(yōu)化連接肽的氨基酸殘基位置取向和剛?cè)嵝?能達到改善效果。
[Abstract]:Industrial enzymes are food production, use of biological catalysis method and medicine, the main source of enzyme chemical products. They are chiral, stereoisomers and domain specificity, and is simple in medium (such as water) instead of specific media (such as organic solvent and other solution) in recognition of substrate ability. Lipase is alpha protein folding or beta hydrolase, the splitter is as everyone knows. From thermophilic lipase can withstand high temperature, can be used in industrial process. Moreover, the stability and expression of these enzymes can show it to improve on the surface of spore bacillus. Display significant effect, low cost, less time-consuming, so it is very promising the technology can be applied to environmental, medical and industrial industries. Spores can withstand the harsh industrial environment, including heat resistance, alkali resistance, chemical solvent resistance, easy recovery and recycling, so the spore display technology industry 涓氫腑搴旂敤鍓嶆櫙騫挎硾.閰墊瘝鑿屽拰緇嗚弻(鍖呮嫭闈╁叞姘忛槼鎬у拰闃存，

本文編號：1683675