本文選題：斑馬魚　切入點(diǎn)：gata6　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：胰腺是脊椎動(dòng)物中參與營養(yǎng)代謝和血糖平衡的重要器官。心血管系統(tǒng)負(fù)責(zé)氧氣、二氧化碳、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運(yùn)輸及調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。斑馬魚為小型亞熱帶淡水魚,胚胎體外發(fā)育,胚胎透明易觀察,單次產(chǎn)量高,成熟周期短,易于飼養(yǎng)等優(yōu)勢使其成為理想的脊椎動(dòng)物模型,可用于消化器官和心血管系統(tǒng)發(fā)育。在斑馬魚中胰腺由背側(cè)胰芽(dorsal bud)和腹側(cè)胰芽(ventral bud)融合發(fā)育而來,背側(cè)胰芽在24hpf出現(xiàn),主要發(fā)育成內(nèi)分泌細(xì)胞(endocrine),腹側(cè)胰芽在34hpf開始出現(xiàn),主要發(fā)育成外分泌細(xì)胞(exocrine)及少部分內(nèi)分泌細(xì)胞。心臟則是由兩側(cè)的心肌祖細(xì)胞向背側(cè)中線遷移并融合形成圓錐狀,心內(nèi)膜祖細(xì)胞在圓錐體中間,當(dāng)圓錐轉(zhuǎn)變成心臟管后心內(nèi)膜祖細(xì)胞將形成心內(nèi)膜細(xì)胞并形成空腔。這兩個(gè)器官形成受一系列動(dòng)態(tài)變化的信號和轉(zhuǎn)錄因子精確調(diào)控,gata6在這兩個(gè)器官中均有表達(dá),這暗示著gata6可能參與調(diào)控胰腺和心臟的發(fā)育,但是到目前為止gata6參與調(diào)控胰腺和心臟發(fā)育的具體分子機(jī)制尚未完全闡釋。gata6是GATA鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族一員,主要負(fù)責(zé)中胚層和內(nèi)胚層的特化與分化。為了研究gata6在胰腺和心臟發(fā)育中的功能,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了gata6,并獲得了兩個(gè)在外顯子2上分別刪除5個(gè)和20個(gè)堿基的突變體,其突變型mRNA含有早熟終止密碼子,編碼蛋白都為截短蛋白,缺失結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)域。在gata6△20/△20中前腸發(fā)育缺陷、肝臟偏小及外分泌胰腺嚴(yán)重缺失,在3dpf的突變體中trypsin標(biāo)記的分化的外胰為兩小團(tuán)分散的組織。為研究外分泌胰腺祖細(xì)胞的發(fā)育狀況,我們將gata6△20/+雜交至Tg(ptf1a:GFP)背景上,連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)野生型腹側(cè)胰腺祖細(xì)胞只形成一個(gè)腹側(cè)胰芽并且長大,然而在突變體中形成兩個(gè)分離的腹側(cè)胰芽,其正常生長也受到抑制。上述結(jié)果表明在在gata6突變體中腹側(cè)胰芽異位生長且生長受到抑制。前期研究結(jié)果表明LPM遷移缺陷可能會(huì)導(dǎo)致外分泌胰腺發(fā)育缺陷,為了探究腹側(cè)胰芽不能融合的原因,我們檢測了LPM的遷移情況,突變體中LPM遷移正常。文獻(xiàn)表明在小鼠中shh異位表達(dá)會(huì)導(dǎo)致外分泌胰腺發(fā)育缺陷,我們檢測了shha的表達(dá)水平,shha在突變體中的內(nèi)胚層異位過表達(dá),為研究此異位表達(dá)是否為導(dǎo)致胰腺發(fā)育缺陷的原因,我們用cyclopamine抑制Hedgehog信號通路,但是不能挽救突變體的外胰腺缺陷。gata6影響外分泌胰腺發(fā)育的機(jī)制需要進(jìn)一步探索研究。我們還研究了gata6在心臟發(fā)育過程中的功能,觀察發(fā)現(xiàn)在野生型中24hpf開始出現(xiàn)血液循環(huán),然而在突變體此時(shí)沒有血液循環(huán),但是心跳正常,為了進(jìn)一步研究心臟發(fā)育狀況,我們借助轉(zhuǎn)基因魚Tg(flk1:GFP)發(fā)現(xiàn)突變體的心臟流出道(outflow tract)的內(nèi)皮細(xì)胞相互緊靠,沒有形成能夠通過血液細(xì)胞的空腔。在隨后的觀察中發(fā)現(xiàn)大約70%的突變體會(huì)在26hpf到48hpf之間恢復(fù)血液循環(huán)。前期研究表明基因突變體中可能存在遺傳補(bǔ)償效應(yīng),我們檢測發(fā)現(xiàn)gata5在突變體的心臟中表達(dá)水平明顯上升。在突變體中適量敲降gata5可以顯著降低突變體恢復(fù)血流的比例,并且適量注射gata5 mRNA可以逆轉(zhuǎn)此結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道血管形成空腔的機(jī)制存在一種內(nèi)皮細(xì)胞聚集成棒狀結(jié)構(gòu)后內(nèi)皮細(xì)胞極化分開再形成空腔的模式,這種血管形成主要是通過VE-cadherin—PKC—Factin—myosin II途徑。為驗(yàn)證斑馬魚中心臟流出道中空腔形成分子機(jī)制是否符合這種模式,我們用Blebbistatin、Latrunculin B和Nocodazole分別處理22hpf的野生型胚胎,分別抑制myosinII、F-actin和microtubule,發(fā)現(xiàn)用這三種藥都能使心臟流出道不能形成空腔,我們檢測了36hpf時(shí)心臟流出道中PKC表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)sibling中PKC表達(dá)量更高,恢復(fù)血液循環(huán)的突變體比沒有恢復(fù)的突變體有更高的PKC表達(dá)量,gata6/gata5可能是通過直接調(diào)控PKC的表達(dá)量來控制心臟流出道中的空腔的形成。綜上所述,我們的研究為探索gata6在胰腺和心血臟發(fā)育提供了新的信息。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q954.4

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本文編號：1667475