本文選題：神經(jīng)干細胞　切入點：轉(zhuǎn)分化　出處：《昆明理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的能力,能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞群。因神經(jīng)干細胞具備自我更新和多分化潛能的兩個基本特性,以及遷移功能、低免疫性和良好的組織融合性的優(yōu)點,故而成為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病良好的移植材料,但是如何體外獲得并分選出高純度的神經(jīng)干細胞便成為其推向臨床治療關(guān)鍵。在前期的實驗中,我們發(fā)現(xiàn):在成纖維細胞在轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞的過程中,CD133這一細胞表面膜蛋白的表達量在前5天呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢,其后維持高表達狀態(tài)。所以本課題旨在確定CD133這一蛋白能否作為成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞過程中的篩選標(biāo)記,從而為體外分選高純度神經(jīng)干細胞提供理論依據(jù),也為進一步研究轉(zhuǎn)分化機制及神經(jīng)干細胞應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。材料與方法:取65天的獼猴耳部組織獲得成纖維細胞,在35mm的小皿中用包含Sox2、Oct4和Klf4三個轉(zhuǎn)錄因子的逆病毒感染3×104個新生猴成纖維細胞兩次。第三天用胰酶消化,往鋪過5 mg/mLlaminin的一個六孔板中接入l× 105個細胞,并加入3 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)第5天和第七天,分別去掉Y27632和丙戊酸,在第11天時換為神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。期間,對每一天的細胞進行CD133的免疫熒光染色,觀察CD133的表達情況。在第七天時,對細胞進行CD133流式分選,分別收集陽性細胞和陰性細胞繼續(xù)培養(yǎng),并進行神經(jīng)鑒定。結(jié)果:(1)用Sox2、Oct4和Klf4的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成纖維細胞后,每一種病毒的感染效率基本都達到了 80%。(2)雖然隨著天數(shù)的增加,由于細胞大量死亡,CD133的表達有一定增強,但其表達量在宏觀上并沒有顯著增多。(3)經(jīng)鑒定,在轉(zhuǎn)分化第7天利用流式細胞術(shù)分選出的CD133陽性細胞群可以成功轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞,而CD133陰性細胞不能轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞。結(jié)論:CD133可以作為成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞過程中的篩選標(biāo)記。
[Abstract]:Background & AIM: neural stem cells have the ability to differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. A group of cells capable of self-renewal and sufficient to provide a large number of brain tissue cells. Because neural stem cells have two basic characteristics of self-renewal and multi-differentiation potential, as well as the advantages of migration, low immunity and good tissue fusion, So it has become a good transplantation material for the treatment of nervous system diseases, but how to obtain and select high purity neural stem cells in vitro is the key to clinical treatment. We found that the expression of CD133, a membrane protein on the surface of fibroblasts, increased significantly in the first five days during the process of transforming fibroblasts into neural stem cells. The aim of this study was to determine whether the CD133 protein can be used as a screening marker in the process of fibroblast transdifferentiation into neural stem cells, so as to provide a theoretical basis for the separation of high purity neural stem cells in vitro. It also laid a good foundation for further study on the mechanism of transdifferentiation and the application of neural stem cells. Materials and methods: the fibroblasts were obtained from the ear tissue of rhesus monkey after 65 days. The 3 脳 104 neonatal monkey fibroblasts were infected twice with antivirus containing three transcription factors of Sox2 Oct4 and Klf4 in a small dish of 35mm. On the third day, the cells were digested with trypsin, and 1 脳 105 cells were injected into a six-well plate spread over 5 mg/mLlaminin. On the 5th and 7th day of induction, Y27632 and valproic acid were removed and replaced into neural stem cell culture medium on the 11th day. During the induction, the cells were stained with CD133 immunofluorescence staining on each day. The expression of CD133 was observed. On the seventh day, CD133 flow sorting was carried out on the cells, positive and negative cells were collected and cultured, and the nerve was identified. Results: the fibroblasts were infected with the retrovirus of Sox2Oct4 and Klf4. The infection efficiency of each virus basically reached 80%.) although the expression of CD133 increased with the increase of days, the expression of CD133 was not significantly increased in macroscopically. On the 7th day of transdifferentiation, CD133 positive cells were successfully transformed into neural stem cells by flow cytometry. CD133 negative cells could not be transformed into neural stem cells. Conclusion: CD133 can be used as a screening marker in the process of fibroblast transdifferentiation into neural stem cells.
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q42

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本文編號：1651545