本文選題：蓖麻蠶　切入點：柞蠶　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：烯醇化酶是一種多功能蛋白,在生理病理中有重要作用。目前,對烯醇化酶的了解主要來源于人和病原微生物方面的研究工作,而來自昆蟲方面的研究工作極少。我們實驗室最先開展了昆蟲烯醇化酶的鑒定工作。從柞蠶中分離出2個烯醇化酶基因,分別命名為烯醇化酶Ⅰ和烯醇化酶Ⅱ,并發(fā)現(xiàn)烯醇化酶Ⅱ很可能是鱗翅目昆蟲特異的,且僅在生殖腺中表達,而烯醇化酶Ⅰ則廣泛存在于各種昆蟲中。為了探討烯醇化酶的起源進化,仍需要在更多物種中調(diào)查烯醇化酶Ⅱ的序列特征和組織表達特征,同時需要對烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的酶學特性進行鑒定和比較。本論文中,我們以蓖麻蠶為研究材料,比較了烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的序列特征、發(fā)育表達特征;以柞蠶為研究材料,利用qRT-PCR技術進一步調(diào)查了烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的組織表達特征,進行了原核表達和抗體制備。昆蟲線粒體基因組測序可以為了解線粒體基因組結構、構建物種系統(tǒng)發(fā)育關系等提供基礎數(shù)據(jù)。本論文中,我們對鱗翅目重要害蟲之一的草地螟線粒體基因組做了生物信息學分析,并利用線粒體基因組全序列重建了 24種螟蛾總科(來源于2個家族10個亞家族)昆蟲的系統(tǒng)進化關系。本論文取得的研究結果如下:1.蓖麻蠶烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ分別編碼433和431個氨基酸。蓖麻蠶烯醇化酶Ⅰ與Ⅱ的序列一致性僅為60%,而蓖麻蠶烯醇化酶Ⅰ與已經(jīng)鑒定的鱗翅目昆蟲烯醇化酶Ⅰ在蛋白水平上的序列一致性為91%～97%,蓖麻蠶烯醇化酶Ⅱ與已經(jīng)鑒定的鱗翅目烯醇化酶Ⅱ的序列一致性為84%～92%。進化分析表明,昆蟲烯醇化酶Ⅱ和Ⅰ是獨立進化的。qRT-PCR檢測結果表明,在胚胎期,烯醇化酶Ⅱ屬于痕量表達,而烯醇化酶Ⅰ的表達水平很高;蛹期精巢中烯醇化酶Ⅰ的表達量較低,而烯醇化酶Ⅱ的表達量遠高于Ⅰ。這一結果說明烯醇化酶Ⅱ與生殖發(fā)育有關。2.在柞蠶胚胎發(fā)育期和幼蟲期,烯醇化酶Ⅰ的表達量均高于烯醇化酶Ⅱ;在蛹期,烯醇化酶Ⅰ的表達量也微高于烯醇化酶Ⅱ。同時,我們成功構建了重組表達質粒pET28b(+)-ApenoⅠ和Ⅱ,并獲得了以可溶性或包涵體形式表達的重組蛋白rApenoⅠ和rAenoⅡ。Western blot檢測結果表明,rApeno Ⅰ和rApenoⅡ能正確表達。利用重組蛋白經(jīng)4次免疫家兔后,獲得了高滴度的抗體。免疫學試驗結果表明,ApenoⅠ和Apeno Ⅱ均在柞蠶的血液、生殖腺及脂肪體中表達,進一步試驗發(fā)現(xiàn)所制備的兩個抗體存在嚴重的交叉反應。柞蠶烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ原核表達的成功為下一步開展酶學特性的研究奠定了基礎。3.草地螟線粒體基因組中AT含量及偏好性與螟蛾總科的線粒體基因組基本相似。基因間隔區(qū)雖然分布于15個區(qū)域,但只有位于tRNAGln ND2之間和tRNASer(UCN)和ND1之間的2個區(qū)域的基因序列在螟蛾總科均存在。鑒定了草地螟A+T富集區(qū)的3個保守序列�；诰�粒體基因組全序列的系統(tǒng)進化分析結果支持螟蛾總科分為螟蛾科和草螟科兩個家族;進一步將草螟科分為兩個進化枝,PS進化枝和非PS進化枝,PS進化枝包括野螟亞科Pyraustinae和斑野螟亞科Spilomelinae,非PS進化枝包括草螟亞科Crambinae、水螟亞科 Acentropinae、苔螟亞科 Scopariinae、禾螟亞科 Schoenobiinae。這是首次利用線粒體基因組全序列探討螟蛾總科的系統(tǒng)發(fā)育關系。
[Abstract]:Enolase is a multifunctional protein that plays an important role in the physiology and pathology. At present, understanding of enolase mainly originates from the research work and the pathogenic microorganism, and the research work from the aspects of insects. We carried out the first few laboratory identification of insect enolization enzyme. The separation of 2 enolase gene from silkworm, named as enolase I and II enolase, and found that the enolase II is likely Lepidoptera specific, and only expressed in the gonad, and enolase 1 is widespread in a variety of insects. In order to investigate the origin and evolution of enolase the enzyme, the expression characteristics of sequence and organization still need to investigate enolase II in more species, and the need for the enol characterization of enzyme I and II were identified and compared. In this thesis, we study on castor silkworm material ratio The sequence characteristics of enolase I and II is developmental expression characteristics; tussah as research materials, further investigation of enolase I and II expression characteristics using qRT-PCR technology, the prokaryotic expression and antibody preparation. Insect mitochondrial genomes can be sequenced in order to understand the structure of the mitochondrial genome, to construct phylogenetic species the relationship can provide the basic data. In this thesis, we on the one of the important pests of Lepidoptera of the meadow moth mitochondrial genome were analyzed using bioinformatics, and mitochondrial genome sequence reconstruction 24 pyraloidea (from 2 families, 10 subfamilies) phylogenetic relationships of insects. The research results achieved are as follows: 1. castor silkworm enolase I and II respectively encoding 433 and 431 amino acids. Sequence eri-silkworm enolase I and II consistency is only 60%, while the enolization enzyme of castor silkworm And has been the identification of lepidopteran enolase 1 at the protein level of sequence identity is 91% ~ 97%, sequence consistency eri-silkworm enolase II and had identified the lepidopteran enolase II is 84% ~ 92%. phylogenetic analysis showed that insect enolase II and I is.QRT-PCR independent test results evolution showed that in the embryo, enolase II belongs to trace expression, while the expression levels of enolase 1 high expression in testis; enolase of amount of pupae was low, whereas the expression of enolase II is much higher than 1. This result indicated that enolase of reproduction and development the.2. in the larval period and silkworm embryonic development, the expression of enolase 1 were higher than that of enolase II; in the pupal stage, the expression of enolase 1 is slightly higher than the enolase II. At the same time, we successfully constructed the recombinant expression plasmid pET28b (+) -Apeno I and II, and The recombinant protein rApeno I and rAeno II.Western blot results to soluble or inclusion bodies expressed that rApeno I and rApeno II can be expressed correctly. Using the recombinant protein after 4 times of immunization of rabbits after obtained high titer antibody. Immunological test results show that the Apeno I and Apeno II in Tussah blood the expression, gonad and fat body, further test the cross reaction exists two antibody preparation. Antheraea pernyi enolase I and II successfully prokaryotic expression to study the enzymatic properties of the next step to lay the foundation of the mitochondrial genome.3. loxostegesticticalis mitochondrial genome AT content and preference and family families are basically similar. Although the intergenic region distributed in 15 regions, but only in the tRNAGln between ND2 and tRNASer (UCN) and 2 gene sequences of ND1 region between the pyraloidea are kept in In. 3 conserved sequences of meadow moth A+T rich regions were identified. The complete sequence of the mitochondrial genome phylogenetic analysis supports pyraloidea divided into Pyralidae and Crambidae two based on family Crambidae; will be further divided into two clades, PS clade and non PS clade, PS in branch including pyraustinae Pyraustinae and spilomelinae Spilomelinae, non PS clade including crambinae Crambinae, nymphulinae Acentropinae, moss moth subfamily Scopariinae, schoenobiinae Schoenobiinae. this is the first use of the mitochondrial genome system pyraloidea full phylogenetic relationship.

【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S433.4;Q966

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