發(fā)布時間：2018-03-12 13:24

  本文選題：主要　切入點(diǎn)：海藻　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：海藻以其豐富的含量和顯著的工業(yè)價值日益被人們重視而。海洋藻類種類繁多,主要以褐藻和紅藻為主。瓊膠、卡拉膠和褐藻膠等海藻膠是海洋藻類的主要成分。面對如此龐大的海藻多糖生物質(zhì),海洋異養(yǎng)微生物能夠消化高分子量的海藻多糖有機(jī)物,將其分解為低分子量物質(zhì)。海洋不計(jì)其數(shù)的與海藻多糖降解相關(guān)的微生物,利用自身基因所編碼表達(dá)的糖苷水解酶(GH)和糖苷裂解酶(PL)參與重要的代謝途徑。從分子層面進(jìn)行分析和表征GH和PL相關(guān)酶類將會為海洋碳循環(huán)研究提供新的思路。本項(xiàng)研究主要對海洋和陸地環(huán)境樣品進(jìn)行樣品富集和菌株篩選,希望獲得能夠降解海藻多糖的的菌種和基因資源。利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析海藻多糖降解酶底物識別的特異性和混雜性模式,推測酶參與催化的關(guān)鍵氨基酸,這將能深入地理解海藻多糖酶高效降解海藻多糖的分子基礎(chǔ)。本研究集中于活性架構(gòu)區(qū)域,推測關(guān)鍵氨基酸殘基功能,試圖闡明酶催化底物的機(jī)制。同時也對分離到的其它有特定功能的新菌進(jìn)行分離和鑒定。1.對近海和陸地環(huán)境樣品進(jìn)行了廣泛地篩選,獲得了兩株細(xì)菌新物種并對其進(jìn)行物種鑒定分析發(fā)現(xiàn),在威海近海海參養(yǎng)殖池的沉積物以及西藏納木錯湖湖水樣品中分離到一些潛在的新種,本研究對分離到的標(biāo)號為N39~T和XZ17~T兩株疑似新菌進(jìn)行了分類鑒定,確定了其系統(tǒng)發(fā)育地位。分子進(jìn)化分析、表型分析、化學(xué)組分分析和生理生化分析的結(jié)果表明:N39~T和 XZ17~T代表了科迪單胞菌屬和類諾卡氏屬的一個新種,根據(jù)以上特征分析,將其分別命名為底泥科迪單胞菌Kordiimonas sediminis和黃色類諾卡氏菌Nocardioides gilvus。2.利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法分析了三類海藻多糖降解酶底物識別特異性和混雜性的模式利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的方法探索了三類海藻多糖降解酶(瓊膠酶,卡拉膠酶和褐藻膠裂解酶)活性架構(gòu)區(qū)域底物結(jié)合模式。分析顯示,五個海藻多糖降解酶家族的活性架構(gòu)處某些氨基酸殘基相比全酶其頻率升高,特別是堿性氨基酸H和R升高幅度最大。這表明極性氨基酸殘基能夠與底物的特異性基團(tuán)如硫酸根、羧酸根或內(nèi)醚氧之間形成氫鍵或靜電相互作用,以此來識別海藻多糖底物。-2和+3亞位點(diǎn)保守氨基酸殘基要明顯多于其它亞位點(diǎn),這也是每個家族的共同識別位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),每一類的同工酶在降解同一種底物時扮演著不同的角色,往往以一種合作的方式共同降解。結(jié)合基因組測序發(fā)現(xiàn),來源于同一種微生物的不同家族的酶能夠協(xié)同降解同一種底物,也許會更高效或更完全。3.完成了褐藻膠裂解酶AlyV4的異源表達(dá)、分離純化,并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征將海洋弧菌Wibrio sp.QY104中表達(dá)的褐藻膠裂解酶基因alyV4連pET-28a(+)載體上,將其轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)獲得了后重組蛋白的活性表達(dá)。對AlyV4的酶學(xué)性質(zhì)檢測分析顯示,該酶的最適溫度和pH分別為40℃和pH 7.6。底物專一性分析表明,該酶能夠降解褐藻酸的三種成分即PMG、PM和PG。構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系得知AlyV4屬于PL7-5家族。該酶的比酶活為5686.28 U/mg,k_m k_(ca)和分別為 1216 mg/mL 和 6274.03 S~(-1)。4.對PL7家族褐藻膠裂解酶AlyV4活性架構(gòu)處關(guān)鍵氨基酸殘基功能進(jìn)行了分析通過活性架構(gòu)處保守氨基酸殘基及Lid-loop上關(guān)鍵氨基酸殘基的突變,發(fā)現(xiàn)各突變體酶活均降低85%以上,可以推測出這些氨基酸殘基在酶的催化過程中起到關(guān)鍵作用。熒光光譜法可以靈敏測得各突變體的結(jié)合力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體的底物結(jié)合力下降,最多降低了 45%左右。酶活與底物結(jié)合力降低程度的不對等程度強(qiáng)烈暗示著酶的催化過程不僅只是包括底物結(jié)合、催化和產(chǎn)物釋放的過程,在底物的結(jié)合與催化之間也可以細(xì)分為幾個階段。最初酶與底物之間進(jìn)行結(jié)合以后,活性架構(gòu)處的關(guān)鍵氨基酸殘基接著要發(fā)揮輔助催化斷鍵的功能,例如-1亞位點(diǎn)的殘基需要輔助糖環(huán)經(jīng)過從船式到椅式的轉(zhuǎn)變從而保證催化殘基能夠順利催化。對產(chǎn)物的熒光輔助糖電泳表明,突變體S76A/R和Y81A/N的產(chǎn)物譜與野生型相比,其降解四糖以上底物的能力降低,說明單個位點(diǎn)的突變即可導(dǎo)致催化模式的改變。通過對活性架構(gòu)處關(guān)鍵氨基酸殘基功能的分析,可為該酶后續(xù)的分子改造奠定了理論與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55

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本文編號：1601743