本文選題：多相分類　切入點(diǎn)：瓊膠降解菌　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：能源、資源、環(huán)境問(wèn)題是21世紀(jì)制約社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。為進(jìn)一步解決能源緊缺問(wèn)題,從海洋中尋找新的生物能源途徑越來(lái)越引起科研人員的重視。海洋面積占地球總面積的70%以上,其中蘊(yùn)藏豐富自然生物資源,并且含有大量可進(jìn)行生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的藻類。瓊膠作為一種海洋功能多糖,是海洋紅藻細(xì)胞壁的主要成分,總量巨大,是生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化的重要來(lái)源之一。另外,瓊膠經(jīng)水解后的寡糖也由于水溶性好,易被機(jī)體吸收的特點(diǎn),在食品,醫(yī)藥,化妝品等領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用前景。微生物作為降解瓊膠的初級(jí)消費(fèi)者,是研究瓊膠生物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及制備瓊膠寡糖的主要物種來(lái)源。因此,本文以細(xì)菌的瓊膠降解為研究主線,開(kāi)展了一系列研究工作。首先,本文完成了包括兩株瓊膠降解菌在內(nèi)的四株海洋新菌的分類鑒定工作。分離自青島養(yǎng)殖池海水并且具有瓊膠降解能力的菌株QM50~T,革蘭氏陰性菌,可以水解瓊脂、明膠、酪蛋白、DNA以及吐溫80,呼吸醌類型為Q-8,主要極性脂為磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。結(jié)合不同生理生化特征,基因組分析以及16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,該菌為科爾韋爾氏菌屬的一個(gè)新物種,建議將其命名為噬瓊膠科爾韋爾氏菌(Colwellia agarivorans sp.nov.)。分離自條斑紫菜表面并且具有瓊膠降解能力的菌株HZ1~T,革蘭氏陰性菌,可以水解瓊脂、明膠、酪蛋白以及吐溫80,呼吸醌類型為MK-6,主要極性脂為磷脂酰乙醇胺和三個(gè)未被鑒定的脂質(zhì)。結(jié)合不同生理生化特征以及16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,菌株HZ1~T為黏著桿菌屬的一個(gè)新物種,建議將其命名為噬瓊膠黏著桿菌(Tenacibaculum agarivorans sp.nov.)。分離自鯊魚(yú)腮的中度嗜鹽菌SS9T,革蘭氏陰性菌,最適生長(zhǎng)鹽度為6%,能夠積累PHA,呼吸醌類型為Q-9,主要極性脂為磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。結(jié)合不同生理生化特征,16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析以及MLSA分析,該菌為是鹽單胞菌科的一個(gè)新屬新種,建議將其命名為橙色鯊魚(yú)球菌(Pistricoccus aurantiacus gen.nov.,sp.nov.)。分離自威海近海沉積物的菌株N211~T,革蘭氏陰性菌,可以水解明膠和吐溫80,呼吸醌類型為Q-8,主要極性脂為磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和一種未被鑒定的脂質(zhì)。結(jié)合不同生理生化特征和16SrRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,該菌為深海桿菌屬的一個(gè)新物種,建議將其命名為沉積物深海桿菌(Thalassotaleasediminis sp.nov.)。另外,還對(duì)鑒定的兩株瓊膠降解菌進(jìn)行了基因組測(cè)序,結(jié)果顯示菌株QM50~T的基因組大小為4.7 Mb,GC含量為35.8%,利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,該菌株存在5條β-瓊膠酶基因,4條卡拉膠酶基因和1條褐藻膠酶基因。菌株HZ1~T的基因組大小為5.6 Mb,GC含量為30.9%,利用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋,該菌存在11條β-瓊膠酶基因,1條α-瓊膠酶基因,2條卡拉膠酶基因和1條褐藻膠酶基因。并且這兩株菌還注釋出不完全相同的半乳糖代謝通路。然后,本文對(duì)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室之前鑒定的兩株瓊膠降解菌HQM9~T和Q1~T的11條瓊膠酶基因和6條新瓊二糖水解酶基因進(jìn)行了外源表達(dá)分析。利用生物信息學(xué)分析,除瓊膠酶AgaAJ屬于GH86家族,瓊膠酶Q1B2屬于GH118家族外,其余9條瓊膠酶基因都屬于GH16家族,6條新瓊二糖水解酶基因?qū)儆贕H117家族。并且經(jīng)過(guò)對(duì)瓊膠降解酶基因的外源表達(dá)過(guò)程,我們成功構(gòu)建了 11條瓊膠酶的基因工程菌,經(jīng)表達(dá)檢測(cè)及酶活分析,9條瓊膠酶進(jìn)行了重組蛋白表達(dá)并顯示出一定活性。而6條新瓊二糖水解酶基因中只有四條基因被成功表達(dá),除了NABH1表達(dá)可見(jiàn)的可溶性重組蛋白外,其余3條基因均表達(dá)包涵體,經(jīng)底物水解檢測(cè),這四條重組的新瓊二糖水解酶沒(méi)有顯示出降解底物的能力。對(duì)多個(gè)重組酶進(jìn)行純化,最后利用親和層析結(jié)合包涵體復(fù)性的方式成功純化出重組瓊膠酶Q1B1,對(duì)其進(jìn)行生理生化特征鑒定,重組酶Q1B1在底物為1%時(shí)的比酶活為222.84 U/mg,并且具有瓊膠底物專一性,它的最適反應(yīng)溫度為40℃,最適底物濃度為1.6%,最適反應(yīng)的pH值為8,DTT對(duì)酶活的促進(jìn)有很大影響。純化后的重組酶以瓊脂糖為底物時(shí)的最終降解產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖,它的最小降解底物為純的新瓊六糖。最后,本文還從基因轉(zhuǎn)錄水平分析了菌株Q1T在瓊脂糖誘導(dǎo)條件下,在不同時(shí)間瓊膠降解相關(guān)基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示瓊膠降解酶基因的表達(dá)集中于菌株誘導(dǎo)生長(zhǎng)的前期,并隨著菌株生長(zhǎng)持續(xù)減弱,至菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后期時(shí),瓊膠降解基因基本停止表達(dá)。另外,根據(jù)瓊膠降解基因在基因組上的分布,菌株Q1T中的瓊膠降解酶基因大部分可能屬于單獨(dú)調(diào)控型,雖集中表達(dá),但表達(dá)量只與誘導(dǎo)條件有關(guān),而與基因所處位置無(wú)關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q93

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1 許振興;四株海洋新菌的鑒定及菌株HQM9~T和Q1~T的瓊膠降解酶研究[D];山東大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1585781