本文關鍵詞： 草酸青霉 內切葡聚糖酶 異源表達 酶學性質 組成型表達　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：自然界是豐富的生物質資源庫。隨著化石燃料的枯竭以及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,世界各國的科學家們將目光投向自然界中的可再生資源。利用可再生資源轉化獲得生物乙醇和生物柴油被寄予厚望。目前,在可再生資源的利用中,酶解法因為溫和的反應條件,不產生有毒物質等優(yōu)點受到青睞。目前通過遺傳操作改造單一酶組分活性來提高纖維素降解能力是一個有效的途徑,但想大幅提高纖維素酶系的纖維素降解能力很難。研究纖維素酶系各組分酶學性質和功能,對于完善纖維素酶系的功能,重構適合不同底物的酶復合物具有重要意義。大部分纖維素酶基因為誘導表達基因,在非誘導條件下存在基礎性表達。普遍接受的模型是,基礎性表達的纖維素酶將外源纖維素降解為纖維寡糖,纖維寡糖進一步誘導纖維素酶基因的表達。除了誘導型基因外,還存在組成型表達的纖維素酶基因,在誘導前期,這些非誘導型纖維素酶與基礎性表達纖維素酶一樣——將纖維素降解為纖維寡糖,促進纖維素酶基因的誘導表達。鑒定這些纖維素酶的功能,對于纖維素酶基因誘導調控網(wǎng)絡的完善具有重要意義。本論文的主要研究進展如下:1.內切纖維素酶在畢赤靜母中的表達設計 Cel5B、Cel5D、Cel5E、Cel5F、Cel12A、Cel12B 和 Cel12C 編碼基因引物。將酶切位點加在引物的5'端,并在C端添加6-8個His標簽。以114-2的cDNA為模板,擴增得到了其中的7個目的片段。通過限制性核酸內切酶處理目的片段和載體,連接構建重組載體。通過電轉化的方法將線性化的重組載體轉入畢赤酵母。甲醇誘導重組蛋白的表達,并通過SDS-PAGE進行分析,成功獲得重組蛋白 rCel5B、rCel5E、rCel12A、rCel12B 和 rCel12C。2.重組蛋白的獲得和酶學性質測定通過親和純化獲得重組酶蛋白rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCe15B和rCel5E。以刺槐豆膠、木聚糖、CMC-N玖、pNPG、pNPX、水楊苷、蔗糖、果膠、淀粉和聚半乳糖醛酸10種底物測定重組蛋白的底物特異性。結果顯示,它們均屬于纖維素內切酶。rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B 和 rCel5E 降解 CMC-Na 的比活力分別為 2.46IU/mg、0.97IU/mg、0.63IU/mg、2.32IU/mg 和 5.07IU/mg。其中 rCe15E 降解 CMC-Na 的能力是 rCe15B 和 rCel12A 的 2 倍,是 rCel12B 的 5.2倍、rCel12C的8.0倍。重組蛋白中,rCel12A的最適溫度是50°,其余4種重組蛋白的最適溫度均為60℃。它們的最適pH處于4-6之間,其中rCel5B、rCe15E和rCel12B的最適pH為4,rCel12C的最適pH為5,rCel12A的最適pH則為6。熱穩(wěn)定性實驗顯示,rCel12A耐熱性差,在50℃下保溫30min之后,活力僅為初始的25%。rCel12B在50℃下保溫120 min后依然能保持50%的活力。在60℃下保溫120 min后,rCel5B和rCel5E依然保持有最初活力的60%-70%,但在70℃下,所有重組內切酶均快速喪失活力。結果顯示GH5家族的rCel5B和rCel5E的熱穩(wěn)定性要好于來自于GH12家族的rCel12A和rCel12B。重組內切酶水解再生無定形纖維素(RAC)的結果顯示,產物主要為二糖和三糖。3.組成型纖維素酶的功能初探以草酸青霉114-2為出發(fā)菌株,通過同源重組的方式獲得Δcel12C、Δcel5E、Δcel5F、Δcel61B和 Δcel61C5個單基因敲除株,Acel12CΔcel5E、Δcel5FΔcel5E、Δcel61BΔcel5E、Acel61BΔcel5F、Acel61CΔcel5E 和 Δcel61CΔcel5F6 個雙基因敲除菌株。各基因敲除株與野生菌株相比,在葡萄糖、PDA和纖維素培養(yǎng)條件下的表型以及孢子萌發(fā)水平未見明顯差異。cel12C、ce15E、cel5F、cel61B和cel61C的生物學功能需要繼續(xù)探索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐春厚,邵紅,倪宏波;纖維素酶菌種的鑒定與篩選[J];中國飼料;2000年13期

2 楊葉東,韓yN君,張金龍;纖維素酶的研究、生產及其在紡織上的應用[J];激光生物學報;2000年02期

3 卜登攀;飼用纖維素酶及產酶微生物[J];寧夏農學院學報;2000年04期

4 傅力,丁友f ,張篪;纖維素酶測定方法的研究[J];新疆農業(yè)大學學報;2000年02期

5 周春暉;孫加龍;;纖維素酶及其應用[J];中國商辦工業(yè);2002年02期

6 孟雷,陳冠軍,王怡,高培基;纖維素酶的多型性[J];纖維素科學與技術;2002年02期

7 楊永彬,黃諺諺,林躍鑫;纖維素酶的結構及分子多樣性[J];生命的化學;2004年03期

8 農向;伍紅;秦天鶯;向會耀;;纖維素酶的研究進展[J];西南民族大學學報(自然科學版);2005年S1期

9 胡學智;酸性纖維素酶產酶活性達到新高[J];工業(yè)微生物;2005年01期

10 陳小堅;;纖維素酶的分子生物學研究及應用進展[J];湖北民族學院學報(醫(yī)學版);2006年04期

相關會議論文 前10條

1 呂東海;周巖民;李如治;;飼用纖維素酶及其應用研究進展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應用[C];2005年

2 陳清華;馮欽龍;周輝;;纖維素酶生產的研究進展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應用[C];2005年

3 楊家華;郭志宏;;纖維素酶在反芻動物生產上的應用[A];中國奶牛協(xié)會2007年會論文集（上冊）[C];2007年

4 曾濤;曾會才;陳漢清;;海南省部分纖維素酶高產菌株的分離與鑒定[A];2009年海南省微生物學檢測及質量保證研討會論文集[C];2009年

5 王鳳超;陳冠軍;劉巍峰;;環(huán)境基因組文庫的構建及纖維素酶基因的篩選[A];2008年中國微生物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

6 王娟;李欣;吳松剛;黃建忠;;長梗木霉外切纖維素酶基因的克隆及其表達[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2009年學術交流會論文摘要匯編[C];2009年

7 王驥;丁明;李燕紅;陳清西;許根俊;趙輔昆;;動物內源性纖維素酶:福壽螺(Ampullaria crossean)多功能纖維素酶基因的克隆[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2003年學術交流會論文摘要集[C];2003年

8 馮文英;;固體纖維素酶的浸漬條件優(yōu)化及其特性研究[A];中國造紙學報2003年增刊——中國造紙學會第十一屆學術年會論文集[C];2003年

9 趙輔昆;王驥;陳清西;許根俊;;纖維素酶的研究進展[A];第七屆全國酶學學術討論會論文摘要集[C];2004年

10 姚強;黃琰;陳冠軍;;產耐堿性纖維素酶絲狀真菌的篩選及研究[A];山東微生物學會第六次會員代表大會暨2004年學術年會論文集（上）[C];2004年

相關重要報紙文章 前10條

1 平遠 譯;纖維素酶可提高秸稈飼料利用率[N];福建科技報;2004年

2 河北農業(yè)大學動物科技學院 孫洪新邋甄二英;纖維素酶在動物營養(yǎng)中的應用[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2008年

3 王菁莎　王頡 劉景彬;纖維素酶的應用現(xiàn)狀[N];中國食品質量報;2009年

4 劉國信;開發(fā)纖維素酶制劑大有可為[N];經(jīng)理日報;2004年

5 陸慕寒 整理;35項印染行業(yè)節(jié)能減排先進技術——助劑篇(二)[N];中國紡織報;2008年

6 山東農業(yè)大學 王紀亭;飼料原料資源匱乏出路何在[N];中國畜牧報;2003年

7 ;2009年印染行業(yè)節(jié)能減排優(yōu)秀技術創(chuàng)新成果推介[N];中國紡織報;2009年

8 馮衛(wèi)東;科技將這樣改變我們的生活[N];科技日報;2008年

9 ;高活力纖維素酶生產技術　[N];中國化工報;2002年

10 本報記者 李曉巖;生物煉制：突破纖維素利用瓶頸[N];中國化工報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 張慶;瑞氏木霉纖維素酶降解模式及其功能多樣性研究[D];山東大學;2015年

2 張聰;Cytophaga hutchinsoni纖維素酶系研究[D];山東大學;2015年

3 韓超;嗜熱真菌新的熱穩(wěn)定纖維素酶的克隆、表達和功能研究[D];山東農業(yè)大學;2015年

4 呂新星;里氏木霉纖維素酶基因轉錄調控因子Xyr1功能研究及銅離子響應高效表達體系的建立[D];山東大學;2015年

5 郭紅;高固體系纖維素酶水解與回收強化研究[D];天津大學;2015年

6 劉奎美;纖維素酶轉錄調控因子及纖維素酶應用的研究[D];山東大學;2016年

7 韓小龍;纖維素酶補料發(fā)酵工藝及木糖渣生產葡萄糖酸鈉的研究[D];山東大學;2017年

8 王美美;耐堿性纖維素酶的表達及其對紙漿改性和機制研究[D];山東大學;2017年

9 周峻沛;云斑天牛胃腸道內共生細菌來源的纖維素酶和半纖維素酶的初步研究[D];中國農業(yè)科學院;2010年

10 韋小敏;斜臥青霉胞外蛋白質組學分析與纖維素酶合成調控機制研究[D];山東大學;2011年

相關碩士學位論文 前10條

1 耿月姍;纖維素酶在幾種咪唑類離子液體中活性研究[D];天津大學;2009年

2 錢文佳;南極細菌產低溫纖維素酶的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2009年

3 舒勤;嗜堿性芽孢桿菌Bacillus sp.AC-2產纖維素酶的研究[D];浙江大學;2004年

4 趙燕;高效纖維素酶高產菌的篩選及相關研究[D];武漢科技大學;2013年

5 李娜;耐熱真菌纖維素酶基因的克隆與序列分析[D];山東農業(yè)大學;2013年

6 田海嬌;纖維素酶生產菌的篩選、誘變及產酶機制的初步研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

7 訾曉雪;不同底物誘導下樺剝管菌纖維素酶活和蛋白質組學研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

8 譚玲;高效水解甘油有機溶劑預處理麥草纖維素酶制劑的選擇和復配[D];江南大學;2015年

9 李靖一;pGAP調控下的內切纖維素酶組成型表達及酶制劑的制備[D];河北農業(yè)大學;2015年

10 王帥;纖維素酶活性架構及TrCel12A關鍵亞位點氨基酸功能研究[D];山東大學;2015年

，

本文編號：1544356