本文關(guān)鍵詞： 草酸青霉 內(nèi)切葡聚糖酶 異源表達 酶學(xué)性質(zhì) 組成型表達　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自然界是豐富的生物質(zhì)資源庫。隨著化石燃料的枯竭以及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,世界各國的科學(xué)家們將目光投向自然界中的可再生資源。利用可再生資源轉(zhuǎn)化獲得生物乙醇和生物柴油被寄予厚望。目前,在可再生資源的利用中,酶解法因為溫和的反應(yīng)條件,不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等優(yōu)點受到青睞。目前通過遺傳操作改造單一酶組分活性來提高纖維素降解能力是一個有效的途徑,但想大幅提高纖維素酶系的纖維素降解能力很難。研究纖維素酶系各組分酶學(xué)性質(zhì)和功能,對于完善纖維素酶系的功能,重構(gòu)適合不同底物的酶復(fù)合物具有重要意義。大部分纖維素酶基因為誘導(dǎo)表達基因,在非誘導(dǎo)條件下存在基礎(chǔ)性表達。普遍接受的模型是,基礎(chǔ)性表達的纖維素酶將外源纖維素降解為纖維寡糖,纖維寡糖進一步誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達。除了誘導(dǎo)型基因外,還存在組成型表達的纖維素酶基因,在誘導(dǎo)前期,這些非誘導(dǎo)型纖維素酶與基礎(chǔ)性表達纖維素酶一樣——將纖維素降解為纖維寡糖,促進纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達。鑒定這些纖維素酶的功能,對于纖維素酶基因誘導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的完善具有重要意義。本論文的主要研究進展如下:1.內(nèi)切纖維素酶在畢赤靜母中的表達設(shè)計 Cel5B、Cel5D、Cel5E、Cel5F、Cel12A、Cel12B 和 Cel12C 編碼基因引物。將酶切位點加在引物的5'端,并在C端添加6-8個His標(biāo)簽。以114-2的cDNA為模板,擴增得到了其中的7個目的片段。通過限制性核酸內(nèi)切酶處理目的片段和載體,連接構(gòu)建重組載體。通過電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母。甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達,并通過SDS-PAGE進行分析,成功獲得重組蛋白 rCel5B、rCel5E、rCel12A、rCel12B 和 rCel12C。2.重組蛋白的獲得和酶學(xué)性質(zhì)測定通過親和純化獲得重組酶蛋白rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCe15B和rCel5E。以刺槐豆膠、木聚糖、CMC-N玖、pNPG、pNPX、水楊苷、蔗糖、果膠、淀粉和聚半乳糖醛酸10種底物測定重組蛋白的底物特異性。結(jié)果顯示,它們均屬于纖維素內(nèi)切酶。rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B 和 rCel5E 降解 CMC-Na 的比活力分別為 2.46IU/mg、0.97IU/mg、0.63IU/mg、2.32IU/mg 和 5.07IU/mg。其中 rCe15E 降解 CMC-Na 的能力是 rCe15B 和 rCel12A 的 2 倍,是 rCel12B 的 5.2倍、rCel12C的8.0倍。重組蛋白中,rCel12A的最適溫度是50°,其余4種重組蛋白的最適溫度均為60℃。它們的最適pH處于4-6之間,其中rCel5B、rCe15E和rCel12B的最適pH為4,rCel12C的最適pH為5,rCel12A的最適pH則為6。熱穩(wěn)定性實驗顯示,rCel12A耐熱性差,在50℃下保溫30min之后,活力僅為初始的25%。rCel12B在50℃下保溫120 min后依然能保持50%的活力。在60℃下保溫120 min后,rCel5B和rCel5E依然保持有最初活力的60%-70%,但在70℃下,所有重組內(nèi)切酶均快速喪失活力。結(jié)果顯示GH5家族的rCel5B和rCel5E的熱穩(wěn)定性要好于來自于GH12家族的rCel12A和rCel12B。重組內(nèi)切酶水解再生無定形纖維素(RAC)的結(jié)果顯示,產(chǎn)物主要為二糖和三糖。3.組成型纖維素酶的功能初探以草酸青霉114-2為出發(fā)菌株,通過同源重組的方式獲得Δcel12C、Δcel5E、Δcel5F、Δcel61B和 Δcel61C5個單基因敲除株,Acel12CΔcel5E、Δcel5FΔcel5E、Δcel61BΔcel5E、Acel61BΔcel5F、Acel61CΔcel5E 和 Δcel61CΔcel5F6 個雙基因敲除菌株。各基因敲除株與野生菌株相比,在葡萄糖、PDA和纖維素培養(yǎng)條件下的表型以及孢子萌發(fā)水平未見明顯差異。cel12C、ce15E、cel5F、cel61B和cel61C的生物學(xué)功能需要繼續(xù)探索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐春厚,邵紅,倪宏波;纖維素酶菌種的鑒定與篩選[J];中國飼料;2000年13期

2 楊葉東,韓yN君,張金龍;纖維素酶的研究、生產(chǎn)及其在紡織上的應(yīng)用[J];激光生物學(xué)報;2000年02期

3 卜登攀;飼用纖維素酶及產(chǎn)酶微生物[J];寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報;2000年04期

4 傅力,丁友f ,張篪;纖維素酶測定方法的研究[J];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2000年02期

5 周春暉;孫加龍;;纖維素酶及其應(yīng)用[J];中國商辦工業(yè);2002年02期

6 孟雷,陳冠軍,王怡,高培基;纖維素酶的多型性[J];纖維素科學(xué)與技術(shù);2002年02期

7 楊永彬,黃諺諺,林躍鑫;纖維素酶的結(jié)構(gòu)及分子多樣性[J];生命的化學(xué);2004年03期

8 農(nóng)向;伍紅;秦天鶯;向會耀;;纖維素酶的研究進展[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年S1期

9 胡學(xué)智;酸性纖維素酶產(chǎn)酶活性達到新高[J];工業(yè)微生物;2005年01期

10 陳小堅;;纖維素酶的分子生物學(xué)研究及應(yīng)用進展[J];湖北民族學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 呂東海;周巖民;李如治;;飼用纖維素酶及其應(yīng)用研究進展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[C];2005年

2 陳清華;馮欽龍;周輝;;纖維素酶生產(chǎn)的研究進展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[C];2005年

3 楊家華;郭志宏;;纖維素酶在反芻動物生產(chǎn)上的應(yīng)用[A];中國奶牛協(xié)會2007年會論文集（上冊）[C];2007年

4 曾濤;曾會才;陳漢清;;海南省部分纖維素酶高產(chǎn)菌株的分離與鑒定[A];2009年海南省微生物學(xué)檢測及質(zhì)量保證研討會論文集[C];2009年

5 王鳳超;陳冠軍;劉巍峰;;環(huán)境基因組文庫的構(gòu)建及纖維素酶基因的篩選[A];2008年中國微生物學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

6 王娟;李欣;吳松剛;黃建忠;;長梗木霉外切纖維素酶基因的克隆及其表達[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2009年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2009年

7 王驥;丁明;李燕紅;陳清西;許根俊;趙輔昆;;動物內(nèi)源性纖維素酶:福壽螺(Ampullaria crossean)多功能纖維素酶基因的克隆[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2003年學(xué)術(shù)交流會論文摘要集[C];2003年

8 馮文英;;固體纖維素酶的浸漬條件優(yōu)化及其特性研究[A];中國造紙學(xué)報2003年增刊——中國造紙學(xué)會第十一屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2003年

9 趙輔昆;王驥;陳清西;許根俊;;纖維素酶的研究進展[A];第七屆全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2004年

10 姚強;黃琰;陳冠軍;;產(chǎn)耐堿性纖維素酶絲狀真菌的篩選及研究[A];山東微生物學(xué)會第六次會員代表大會暨2004年學(xué)術(shù)年會論文集（上）[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 平遠 譯;纖維素酶可提高秸稈飼料利用率[N];福建科技報;2004年

2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 孫洪新邋甄二英;纖維素酶在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2008年

3 王菁莎　王頡 劉景彬;纖維素酶的應(yīng)用現(xiàn)狀[N];中國食品質(zhì)量報;2009年

4 劉國信;開發(fā)纖維素酶制劑大有可為[N];經(jīng)理日報;2004年

5 陸慕寒 整理;35項印染行業(yè)節(jié)能減排先進技術(shù)——助劑篇(二)[N];中國紡織報;2008年

6 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 王紀(jì)亭;飼料原料資源匱乏出路何在[N];中國畜牧報;2003年

7 ;2009年印染行業(yè)節(jié)能減排優(yōu)秀技術(shù)創(chuàng)新成果推介[N];中國紡織報;2009年

8 馮衛(wèi)東;科技將這樣改變我們的生活[N];科技日報;2008年

9 ;高活力纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)　[N];中國化工報;2002年

10 本報記者 李曉巖;生物煉制：突破纖維素利用瓶頸[N];中國化工報;2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張慶;瑞氏木霉纖維素酶降解模式及其功能多樣性研究[D];山東大學(xué);2015年

2 張聰;Cytophaga hutchinsoni纖維素酶系研究[D];山東大學(xué);2015年

3 韓超;嗜熱真菌新的熱穩(wěn)定纖維素酶的克隆、表達和功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 呂新星;里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyr1功能研究及銅離子響應(yīng)高效表達體系的建立[D];山東大學(xué);2015年

5 郭紅;高固體系纖維素酶水解與回收強化研究[D];天津大學(xué);2015年

6 劉奎美;纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及纖維素酶應(yīng)用的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 韓小龍;纖維素酶補料發(fā)酵工藝及木糖渣生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究[D];山東大學(xué);2017年

8 王美美;耐堿性纖維素酶的表達及其對紙漿改性和機制研究[D];山東大學(xué);2017年

9 周峻沛;云斑天牛胃腸道內(nèi)共生細(xì)菌來源的纖維素酶和半纖維素酶的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

10 韋小敏;斜臥青霉胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析與纖維素酶合成調(diào)控機制研究[D];山東大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 耿月姍;纖維素酶在幾種咪唑類離子液體中活性研究[D];天津大學(xué);2009年

2 錢文佳;南極細(xì)菌產(chǎn)低溫纖維素酶的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2009年

3 舒勤;嗜堿性芽孢桿菌Bacillus sp.AC-2產(chǎn)纖維素酶的研究[D];浙江大學(xué);2004年

4 趙燕;高效纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選及相關(guān)研究[D];武漢科技大學(xué);2013年

5 李娜;耐熱真菌纖維素酶基因的克隆與序列分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 田海嬌;纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選、誘變及產(chǎn)酶機制的初步研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

7 訾曉雪;不同底物誘導(dǎo)下樺剝管菌纖維素酶活和蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

8 譚玲;高效水解甘油有機溶劑預(yù)處理麥草纖維素酶制劑的選擇和復(fù)配[D];江南大學(xué);2015年

9 李靖一;pGAP調(diào)控下的內(nèi)切纖維素酶組成型表達及酶制劑的制備[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 王帥;纖維素酶活性架構(gòu)及TrCel12A關(guān)鍵亞位點氨基酸功能研究[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號：1544356