本文關(guān)鍵詞： 萊茵衣藻 脂肪酸分泌 �；o酶A合成酶 DOF轉(zhuǎn)錄因子 多基因調(diào)控　出處：《深圳大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著化石能源的枯竭和環(huán)境污染的加劇,新一代微藻生物柴油技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。利用基因工程手段調(diào)控微藻油脂關(guān)鍵基因,增加微藻油脂含量的研究已成為降低微藻柴油成本的重要途徑。到目前為止,本實(shí)驗(yàn)室利用模式微藻——萊茵衣藻,進(jìn)行油脂代謝調(diào)控的研究也取得了重要進(jìn)展:一方面我們發(fā)現(xiàn)在萊茵衣藻中過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子,能顯著增加其胞內(nèi)的油脂含量;另一方面,我們也發(fā)現(xiàn)在萊茵衣藻內(nèi)分別沉默長(zhǎng)鏈�；o酶A合成酶的兩個(gè)基因ACS1和ACS2也能增加胞內(nèi)油脂含量,并且能在一定程度上實(shí)現(xiàn)微藻的脂肪酸胞外分泌。但是上述基因之間是否存在相互關(guān)系?能否對(duì)這些基因進(jìn)行同時(shí)調(diào)控?基于這些問題,我們開展了本研究。本論文采用了連續(xù)多次轉(zhuǎn)化的方式構(gòu)建出ACS1和ACS2共沉默的工程藻Mq12,在萊茵衣藻中實(shí)現(xiàn)了多基因的共沉默。與單基因沉默藻株相比,共沉默工程藻的胞內(nèi)油脂含量有明顯提高。在此基礎(chǔ)上,本論文也進(jìn)一步構(gòu)建了沉默ACS2同時(shí)過表達(dá)DOF的工程藻株Mc7。與單基因調(diào)控藻株相比,工程藻的胞內(nèi)油脂含量也有顯著增加,并且其胞外脂肪酸的分泌量也有明顯提升。證實(shí)了多基因共調(diào)控策略在微藻產(chǎn)油調(diào)控中的重要意義。本論文的具體研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了ACS2基因的RNA干涉載體pMaa7IR/ACS2IR。該載體在萊茵衣藻中表現(xiàn)出巴龍霉素抗性,含有來源于ACS2的421 bp片段組成的發(fā)卡結(jié)構(gòu),該發(fā)卡結(jié)構(gòu)受萊茵衣藻RBCS2啟動(dòng)子調(diào)控,可高效抑制衣藻內(nèi)源ACS2基因的表達(dá)量。2.采用連續(xù)轉(zhuǎn)化的方法,將pMaa7IR/ACS2IR轉(zhuǎn)入已沉默了ACS1基因的工程藻,經(jīng)BODIPY染色篩選獲得ACS2和ACS1基因高效共沉默的工程藻株Mq12。熒光定量PCR檢測(cè)顯示,工程藻Mq12中ACS1基因的表達(dá)量下調(diào)了63%,ACS2基因表達(dá)量下調(diào)了82%。微藻胞內(nèi)甘油酯含量測(cè)定結(jié)果表明,共沉默藻株Mq12的胞內(nèi)甘油酯含量分別比野生藻株CC849、ACS1單沉默藻株Q15和ACS2單沉默藻株P(guān)13提高了200%、73.5%和46.6%。利用GC-MS測(cè)得Mq12胞內(nèi)總脂含量為167.1μg/mg,與CC849、P13、Q15均存在極顯著性差異,分別提高了65%、23%和38%。其中Mq12中C18:3n3和C18:1c與CC849相比分別提高了6倍和2.5倍。這表明ACS1與ACS2共沉默能顯著提高萊茵衣藻胞內(nèi)甘油酯和總脂含量。而胞外脂肪酸數(shù)據(jù)顯示,Mq12分泌的脂肪酸雖然與CC849相比提高了19%,但是與P13和Q15相比并無顯著差異。3.采用連續(xù)轉(zhuǎn)化的方法,將pMaa7IR/ACS2IR轉(zhuǎn)入DOF轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)的工程藻C12中,經(jīng)BODIPY染色篩選獲得ACS2和DOF共調(diào)控的工程藻株Mc7。胞內(nèi)甘油酯含量測(cè)定表明,工程藻Mc7的胞內(nèi)甘油酯含量與野生藻CC849、DOF轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)藻株C12和ACS2單沉默藻株P(guān)13相比都具有極顯著性差異,分別提高了91%、40%和48%。此外,Mc7的胞內(nèi)總脂肪酸含量與CC849、C12和P13相比分別提高了90%、29%和42%,其中與CC849相比,不飽和脂肪酸有大幅度上升。更重要的是,胞外脂肪酸數(shù)據(jù)顯示,Mc7的胞外脂肪酸總量與CC849、C12、P13相比,均具有極顯著性差異,分別提高了67.4%、35.88%、21.5%。與CC849相比,Mc7胞外不飽和脂肪酸有大幅度提高。這一結(jié)果表明共調(diào)控ACS2基因與DOF轉(zhuǎn)錄因子能顯著提高萊茵衣藻胞內(nèi)油脂含量,特別是TAG含量,且其胞外分泌量有明顯增加。綜上所述,本研究在萊茵衣藻中建立了多基因共調(diào)控的方式,實(shí)現(xiàn)了對(duì)ACS基因和DOF轉(zhuǎn)錄因子的同時(shí)調(diào)控,最終獲得了既能提高胞內(nèi)油脂含量又能向胞外分泌脂肪酸的轉(zhuǎn)基因藻株,證實(shí)了ACS和DOF在提高胞內(nèi)油脂含量和促進(jìn)脂肪酸分泌的功能上有相互促進(jìn)效果,為微藻產(chǎn)油提供了新的思路和基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1533640