本文關(guān)鍵詞：CCKAR下游效應(yīng)器的融合蛋白的偏向性信號(hào)通路研究　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：胰島β細(xì)胞作為唯一一類能夠分泌胰島素的分泌細(xì)胞,在機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用,而胰島β細(xì)胞的生理活性會(huì)受到多種激素的共同調(diào)節(jié)。在已經(jīng)發(fā)表的眾多研究中,由小腸粘膜上皮Ⅰ細(xì)胞分泌的膽囊收縮素(Cholecystokinin,CCK)能夠通過與胰島β細(xì)胞中表達(dá)的膽囊收縮素A受體(Cholecystokinin A receptor,CCKAR)結(jié)合來(lái)對(duì)胰島功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。CCKAR作為G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員,與內(nèi)源性激動(dòng)劑CCK的剪切變體CCK-8S結(jié)合后,會(huì)同時(shí)激活由Gs,Gq以及β-arrestin-1介導(dǎo)的多條下游信號(hào)通路,并調(diào)控不同的生理功能。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,已經(jīng)證明了CCKAR受體與CCK-8S相互結(jié)合,能夠通過激活下游的Gs和Gq信號(hào)通路。在胰島β細(xì)胞中,細(xì)胞表面的CCKAR激活后,能夠通過Gs信號(hào)通路調(diào)控胰島β細(xì)胞的胰島素分泌并改變機(jī)體的葡萄糖敏感性,也可以通過Gq信號(hào)通路直接影響并促進(jìn)胰島素的分泌。CCKAR與CCK-8s結(jié)合后,還能夠激活β-arrestin-1信號(hào)通路,并促進(jìn)Bad蛋白的磷酸化來(lái)弱化細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。這些研究結(jié)果表明CCKAR 下游不同信號(hào)通路可調(diào)控胰島β細(xì)胞不同的功能.但CCKAR偏向性途徑具體的作用機(jī)制和CCKAR偏向性信號(hào)的生理意義尚不明確�；谇捌趯�(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們通過設(shè)計(jì)并構(gòu)建CCKAR與G蛋白或arrestin的人工融合蛋白(CCKAR-Gs,CCKAR-Gq 和 CCKAR-β-arrestin-1),運(yùn)用 G 蛋白偶聯(lián)受體經(jīng)典的下游信號(hào)檢測(cè)手段對(duì)于不同融合蛋白的藥理學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)一步檢測(cè)不同信號(hào)偏向性的信號(hào)途徑對(duì)于細(xì)胞凋亡的相關(guān)作用,研究CCKAR下游不同信號(hào)通路所調(diào)控的生理功能,以其為基于CCKAR配體的糖尿病治療藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ),并為其他GPCR的偏向性信號(hào)通路的研究提供新的思路。研究目的運(yùn)用融合蛋白的技術(shù)手段構(gòu)建CCKAR-Gs,CCKAR-Gq和CCCKAR-β-aresstin-1融合蛋白,并檢測(cè)其相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)活性。研究方法1.融合蛋白的構(gòu)建準(zhǔn)備:(1)SLIC-PCR的手段進(jìn)行融合蛋白的構(gòu)建;(2)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況;2.藥理學(xué)性質(zhì)檢測(cè):(1)使用cAMP-GloSensor的手段檢測(cè)細(xì)胞中cAMP含量在CCK-8s刺激后的變化;(2)使用Fura-2鈣成像的手段檢測(cè)細(xì)胞中Ca離子在CCK-8s刺激后的變化;(3)使用免疫印跡的手段檢測(cè)細(xì)胞中ppERK和pBad在CCK-8s刺激后的變化;3.HEK293細(xì)胞系上表達(dá)不同融合蛋白(CCKAR-Gs,CCKAR-Gq,CCCKAR-β-aresstin-1)后細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)研究結(jié)果人工構(gòu)建的CKKAR融合蛋白比較野生型的CCKAR蛋白,能夠在很大的程度上提高下游信號(hào)的偏向型,能夠直接影響并作用于單一的信號(hào)通路上,并且CCKAR-β-arrestin-1融合蛋白的過表達(dá)能夠顯著改善細(xì)胞凋亡情況。結(jié)論人工構(gòu)建的CCKAR融合蛋白能夠有效地、偏向性地激活CCKAR的下游信號(hào)通路,可以選擇性的行使不同信號(hào)通路調(diào)控的生理功能。
[Abstract]:In this study , we have demonstrated that CCKAR can regulate the insulin secretion of islet 尾 cells and regulate the secretion of insulin . The CCKAR is a member of G protein coupled receptor family . Conclusion The constructed CCKAR fusion protein can selectively activate the downstream signal pathway of CCKAR , and can selectively exert physiological functions of different signal pathways .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q75

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