發(fā)布時間：2017-07-08 05:13

  本文關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔無機砷甲基轉(zhuǎn)化及其分子機制的研究

  更多相關(guān)文章： 菲律賓蛤仔 砷 富集 轉(zhuǎn)化 亞細胞分布 GSTΩ 病理變化

【摘要】：砷是自然界廣泛分布的有毒類金屬,水體中砷主要以毒性很高的無機砷形式存在。本論文針對我國近海砷污染現(xiàn)狀,以近岸廣泛分布的海洋環(huán)境監(jiān)測生物菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)為研究對象,采用砷酸鹽(AsⅤ)和亞砷酸鹽(AsⅢ)進行毒性暴露,利用分析化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等技術(shù)手段研究菲律賓蛤仔對無機砷的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律,探討谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Ω(GSTΩ)在菲律賓蛤仔砷代謝過程中的功能機制,并揭示砷暴露下菲律賓蛤仔的組織病理變化,從而為闡明海洋貝類對無機砷的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律及其分子機制提供一定依據(jù),同時也可為貝類安全養(yǎng)殖和食用提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)菲律賓蛤仔對無機砷生物利用率低,對As(Ⅲ)生物利用率高于As(Ⅴ)。菲律賓蛤仔組織中無機砷的轉(zhuǎn)化過程可能既包括As(Ⅴ)還原和甲基轉(zhuǎn)化,還存在As(Ⅲ)氧化。菲律賓蛤仔肝胰腺和鰓組織對無機砷富集轉(zhuǎn)化存在差異,砷更易于在肝胰腺中富集。砷甜菜堿(AsB)和二甲基胂酸鹽(DMA)是組織中主要的砷形態(tài),在肝胰腺中無機砷主要轉(zhuǎn)化為AsB,而鰓組織中無機砷主要轉(zhuǎn)化為DMA。各處理組中金屬硫蛋白樣蛋白(MTLP)是砷在亞細胞水平的主要結(jié)合位點,其次是細胞碎片。金屬敏感組分(MSF)中總砷變化較為明顯,而生物解毒金屬組分(BDM)中總砷含量變化較小,且與肝胰腺相比,鰓組織對砷的解毒能力有限。(2)克隆獲得了菲律賓蛤仔體內(nèi)無機砷甲基化關(guān)鍵酶GSTΩ基因,并對其進行了體外重組表達。GSTΩ重組蛋白具有砷酸鹽還原酶活性,且在底物濃度較高,低pH和常溫(37℃)條件下活性較高。將GSTΩ轉(zhuǎn)化到砷敏感菌株E.coli AW3110(DE3)(ΔarsRBC)后,能夠提高該菌株對無機砷的耐受性,表明其在無機砷的轉(zhuǎn)化和解毒方面發(fā)揮了重要作用。(3)分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測了GSTΩ在無機砷暴露后的表達變化情況以及砷酸鹽還原酶活性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個處理組菲律賓蛤仔肝胰腺和鰓組織GSTΩ相對表達量增加,砷酸鹽還原酶活性升高,進一步表明其可能在菲律賓蛤仔無機砷甲基轉(zhuǎn)化和解毒過程中發(fā)揮了重要作用。采用免疫組化方法對GSTΩ在組織中的表達進行定位,結(jié)果表明GSTΩ蛋白主要在鰓絲上皮細胞以及鰓腔中的血細胞中表達,在消化腔內(nèi)壁上皮細胞中表達。(4)不同濃度無機砷暴露一定時期后,菲律賓蛤仔體內(nèi)GSH含量、GR、GST活性在多個處理組出現(xiàn)活性的顯著升高,表明砷暴露會引發(fā)機體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。隨著暴露時間的增加,在菲律賓蛤仔鰓、肝胰腺、外套膜均已產(chǎn)生不同程度的病理損傷,在100μg/L As(Ⅲ)暴露30天時肝胰腺出現(xiàn)消化管壞死的現(xiàn)象,肌肉纖維也出現(xiàn)斷裂扭曲;鰓絲上皮細胞溶解,出現(xiàn)大量空泡;外套膜內(nèi)表皮和外表皮均出現(xiàn)嚴重損傷。As(Ⅲ)暴露造成的損傷程度高于As(Ⅴ),證實As(Ⅲ)毒性強于As(Ⅴ)的結(jié)論。
【關(guān)鍵詞】：菲律賓蛤仔 砷 富集 轉(zhuǎn)化 亞細胞分布 GSTΩ 病理變化
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X55;S917.4
【目錄】：

• 致謝4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-17
• 縮略詞17-19
• 1 引言19-33
• 1.1 砷概況19-23
• 1.1.1 砷的來源19
• 1.1.2 砷的形態(tài)及毒性19-20
• 1.1.3 砷的生物毒性效應(yīng)20-21
• 1.1.3.1 砷的毒性作用機制20
• 1.1.3.2 砷對人和動物的毒性效應(yīng)20-21
• 1.1.3.3 砷對植物的毒性效應(yīng)21
• 1.1.4 我國水體砷污染現(xiàn)狀21-23
• 1.2 砷的代謝23-28
• 1.2.1 砷的吸收23-24
• 1.2.2 砷的甲基轉(zhuǎn)化24-28
• 1.2.2.1 砷甲基化相關(guān)酶類24-25
• 1.2.2.2 無機砷甲基轉(zhuǎn)化研究進展25-28
• 1.2.3 砷的排出28
• 1.3 重金屬在水生生物中的累積28-30
• 1.3.1 重金屬的生物累積特征28-29
• 1.3.2 重金屬生物累積的亞細胞分布29-30
• 1.4 抗氧化酶系的應(yīng)答在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用30-32
• 1.5 組織病理分析在海洋生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用32-33
• 2 本論文的研究內(nèi)容、意義及技術(shù)路線33-35
• 2.1 研究內(nèi)容與意義33-34
• 2.2 技術(shù)路線34-35
• 3 菲律賓蛤仔組織中砷的富集轉(zhuǎn)化和亞細胞分布35-48
• 3.1 實驗材料35-37
• 3.1.1 實驗動物35-36
• 3.1.2 實驗試劑36
• 3.1.3 實驗儀器36-37
• 3.2 實驗方法37-38
• 3.2.1 菲律賓蛤仔肝胰腺與鰓組織中總砷含量測定37
• 3.2.2 菲律賓蛤仔肝胰腺與鰓組織不同賦存形態(tài)砷含量分析37-38
• 3.2.3 亞細胞組分分布38
• 3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析38
• 3.3 實驗結(jié)果38-44
• 3.3.1 肝胰腺和鰓組織中總砷的富集38-40
• 3.3.2 肝胰腺和鰓組織中不同賦存形態(tài)砷的含量40-42
• 3.3.3 肝胰腺和鰓組織中總砷的亞細胞分布42-44
• 3.4 討論44-47
• 3.4.1 肝胰腺和鰓組織中總砷的富集44-45
• 3.4.2 肝胰腺和鰓組織中不同賦存形態(tài)砷的含量45-46
• 3.4.3 肝胰腺和鰓組織中總砷的亞細胞分布46-47
• 3.5 小結(jié)47-48
• 4 無機砷甲基化關(guān)鍵酶GSTΩ 基因的重組表達及功能驗證48-67
• 4.1 實驗材料49-52
• 4.1.1 實驗樣品49
• 4.1.2 實驗試劑49-51
• 4.1.3 實驗儀器51-52
• 4.2 實驗方法52-61
• 4.2.1 無機砷甲基化關(guān)鍵酶GSTΩ 基因的擴增與原核表達52-58
• 4.2.1.1 菲律賓蛤仔總RNA的提取及cDNA的合成52-53
• 4.2.1.2 砷甲基化關(guān)鍵酶GSTΩ 基因的擴增與克隆53-54
• 4.2.1.3 GSTΩ 重組片段轉(zhuǎn)化表達菌BL21(DE3)與檢測54-56
• 4.2.1.4 重組GSTΩ 蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳及其抗體的Western blot檢測56-58
• 4.2.2 GSTΩ 基因重組蛋白的活性檢測58-59
• 4.2.3 GSTΩ 重組片段在大腸桿菌突變體Escherichia coli AW3110(DE3)中的功能驗證59-61
• 4.3 實驗結(jié)果61-63
• 4.3.1 GSTΩ 基因的重組表達61-62
• 4.3.2 重組GSTΩ 蛋白的活性檢測62-63
• 4.3.3 砷超敏感菌株中驗證GSTΩ 基因的功能63
• 4.4 討論63-65
• 4.4.1 無機砷甲基化關(guān)鍵酶GSTΩ 基因的擴增與原核表達63-64
• 4.4.2 重組GSTΩ 蛋白的活性檢測64
• 4.4.3 砷超敏感菌株中驗證GSTΩ 基因的功能64-65
• 4.5 小結(jié)65-67
• 5 砷甲基化關(guān)鍵基因GSTΩ 對無機砷脅迫的分子響應(yīng)67-81
• 5.1 實驗材料67-69
• 5.1.1 實驗動物67-68
• 5.1.2 實驗試劑68-69
• 5.1.3 實驗儀器69
• 5.2 實驗方法69-73
• 5.2.1 實時定量PCR檢測無機砷暴露后組織中GSTΩ 轉(zhuǎn)錄水平表達量變化69-70
• 5.2.2 無機砷暴露后組織中GSTΩ 蛋白表達分布檢測70-72
• 5.2.3 無機砷暴露后組織中GSTΩ 酶活力變化72-73
• 5.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析73
• 5.3 實驗結(jié)果73-77
• 5.3.1 無機砷暴露后GSTΩ 轉(zhuǎn)錄水平表達量變化73-75
• 5.3.2 無機砷暴露后組織中GSTΩ 蛋白表達分布變化75-77
• 5.3.3 無機砷暴露后組織中GSTΩ 酶活力變化77
• 5.4 討論77-80
• 5.4.1 無機砷暴露后GSTΩ 轉(zhuǎn)錄水平表達量變化77-79
• 5.4.2 無機砷暴露后組織中GSTΩ 蛋白表達分布變化79
• 5.4.3 無機砷暴露后組織中GSTΩ 酶活力變化79-80
• 5.5 小結(jié)80-81
• 6 無機砷暴露后菲律賓蛤仔的病理生理響應(yīng)81-95
• 6.1 實驗材料81-83
• 6.1.1 實驗動物81-82
• 6.1.2 實驗試劑82
• 6.1.3 實驗儀器82-83
• 6.2 實驗方法83-84
• 6.2.1 砷暴露下菲律賓蛤仔體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的測定83
• 6.2.2 砷暴露下菲律賓蛤仔的組織病理變化83-84
• 6.3 實驗結(jié)果84-91
• 6.3.1 無機砷暴露后不同組織GSH含量、GR和總GST活力變化84-87
• 6.3.2 砷暴露下菲律賓蛤仔的組織病理變化87-91
• 6.4 討論91-94
• 6.4.1 無機砷暴露后不同組織GSH含量、GR和總GST活力變化91-93
• 6.4.2 砷暴露下菲律賓蛤仔的組織病理變化93-94
• 6.5 小結(jié)94-95
• 7 結(jié)論與研究展望95-97
• 7.1 本研究的主要結(jié)論95
• 7.2 本研究的主要創(chuàng)新點95-96
• 7.3 需進一步解決的問題96-97
• 參考文獻97-119
• 作者簡介119-120
• 碩士期間發(fā)表論文120

【參考文獻】

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本文編號：533160