Delftia tsuruhatensis AD9能以苯胺或鄰苯二酚為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。與目前已報(bào)道的其它苯胺降解菌比較,該菌表現(xiàn)出較高的苯胺降解速率和較強(qiáng)的苯胺耐受能力。本研究采用基因敲除、lacZ融合表達(dá)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)以及熒光定量PCR等方法,開(kāi)展了D. tsuruhatensis AD9苯胺降解調(diào)控蛋白TadR的功能鑒定和tad基因簇表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。 D. tsuruhatensis AD9苯胺降解基因簇組成結(jié)構(gòu)分析表明,苯胺降解基因分布在三個(gè)操縱子。氨基酸序列分析表明,D. tsuruhatensis AD9的TadR屬于LysR-type家族的調(diào)控蛋白,與苯胺降解菌Pseudomonas putida UCC22的TdnR有97.6%的同源性;OrfS同樣屬于LysR-type家族調(diào)控蛋白,與苯酚降解菌Comamonas testosteroni TA441的AphT氨基酸序列有69%的同源性。苯胺降解基因簇結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可能受到這兩個(gè)LysR-type蛋白的調(diào)控。 為了驗(yàn)證苯胺降解基因簇的表達(dá)調(diào)控,本工作構(gòu)建了tadR的缺失插入突變株。tadR突變株不能以苯胺為唯一...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
Abstract
第一章 微生物中芳香族化合物降解基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進(jìn)展
    1.1 微生物中苯胺降解基因簇的研究進(jìn)展
        1.1.1 微生物中苯胺降解基因簇代謝途徑的研究
        1.1.2 微生物苯胺降解基因簇的克隆
    1.2 微生物中苯胺代謝表達(dá)調(diào)控的研究
        1.2.1 基因水平上苯胺降解基因簇的表達(dá)調(diào)控研究
        1.2.2 蛋白質(zhì)組水平研究苯胺的代謝調(diào)控
        1.2.3 利用代謝工程研究苯胺降解基因簇的表達(dá)調(diào)控
    1.3 微生物中芳香組化合物降解基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進(jìn)展
        1.3.1 LysR-type轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白
        1.3.2 IclR-type調(diào)控蛋白
        1.3.3 AraC-type調(diào)控蛋白
        1.3.4 XylR/NtrC-type調(diào)控蛋白
        1.3.5 GntR-type調(diào)控蛋白
        1.3.6 TetR-, MarM-和FNR-type調(diào)控蛋白
        1.3.7 雙成分信號(hào)家族調(diào)控蛋白
        1.3.8 細(xì)胞生理水平的高級(jí)調(diào)控
    1.4 提高芳烴化合物降解能力的策略
        1.4.1 通過(guò)代謝工程構(gòu)建新的降解途徑
        1.4.2 利用蛋白質(zhì)工程提高降解效率
        1.4.3 提高降解菌的環(huán)境適應(yīng)性
        1.4.4 提高污染物的生物可利用度
        1.4.5 生物安全性
    1.5 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的研究進(jìn)展
        1.5.1 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶結(jié)構(gòu)
        1.5.2 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的反應(yīng)機(jī)制
        1.5.3 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶在不同菌屬中的功能
        1.5.4 苯胺降解基因簇中鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的功能
    1.6 本論文的立題依據(jù)
第二章 LysR-type調(diào)控蛋白TadR的功能鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 酶，試劑和試劑盒
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 抗生素
    2.2 方法
        2.2.1 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.2 基因組DNA提取
        2.2.3 PCR擴(kuò)增及純化
        2.2.4 酶切及連接反應(yīng)
        2.2.5 高效率轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化
        2.2.6 重組子的篩選與鑒定
        2.2.7 三親接合
        2.2.8 苯胺的測(cè)定采用偶氮比色法
        2.2.9 β-半乳糖苷酶活性分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 TadR蛋白序列分析
        2.3.2 調(diào)控蛋白TadR突變株的構(gòu)建過(guò)程
        2.3.3 tadR互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        2.3.4 野生型AD9、突變株AD91、互補(bǔ)菌株AD94 的特征及生理生化測(cè)定
        2.3.5 tadQ啟動(dòng)子驗(yàn)證載體的構(gòu)建
        2.3.6 ONPG法定量測(cè)定結(jié)合子的β-半乳糖苷酶活性
    2.4 討論
第三章 苯胺降解基因簇tad操縱子的分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 酶，試劑及主要儀器
        3.1.3 培養(yǎng)基與抗生素
        3.1.4 引物
    3.2 方法
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 AD9 苯胺降解基因簇中tadD2 的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)
        3.3.2 tadD2 啟動(dòng)子驗(yàn)證載體的構(gòu)建
        3.3.3 tadD2 啟動(dòng)子的活性和誘導(dǎo)譜分析
        3.3.4 tadD2 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析
        3.3.5 tadQ啟動(dòng)子的誘導(dǎo)譜分析
        3.3.6 tadQ啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析
        3.3.7 OrfS的結(jié)構(gòu)分析
        3.3.8 OrfS的系譜分析
    3.4 討論
第四章 TadR調(diào)控蛋白在苯胺降解基因簇中的功能研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 酶，試劑，試劑盒及主要儀器
        4.1.3 培養(yǎng)基與抗生素
        4.1.4 PCR引物
        4.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用溶液及緩沖液
        4.1.6 純化His-Tag融合蛋白的NTA緩沖液的配制
        4.1.7 凝膠阻滯試劑配置
    4.2 原理
        4.2.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)原理
        4.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)原理
    4.3 方法
        4.3.1 SDS-PAGE蛋白電泳操作
        4.3.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.3 蛋白表達(dá)形式的分析
        4.3.4 TadR-His融合蛋白的純化
        4.3.5 總蛋白的測(cè)定
        4.3.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)
        4.3.7 反轉(zhuǎn)錄樣品的處理
        4.3.8 細(xì)菌總RNA的提取
        4.3.9 第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成
        4.3.10 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
        4.3.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的實(shí)驗(yàn)過(guò)程
        4.3.12 數(shù)據(jù)分析
        4.3.13 其它的實(shí)驗(yàn)方法
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 原核表達(dá)載體pETR的構(gòu)建
        4.4.2 融合蛋白TadR的表達(dá)與分析
        4.4.3 融合蛋白TadR的純化與分析
        4.4.4 探針的標(biāo)記結(jié)果
        4.4.5 TadR蛋白與探針的結(jié)合實(shí)驗(yàn)
        4.4.6 RNA的提取
        4.4.7 RT-PCR鑒定AD9 和AD91 中苯胺降解基因簇中各基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)
        4.4.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證苯胺降解基因簇基因的表達(dá)情況
    4.5 討論
第五章 AD9 降解氯代苯胺特征及TadC1, TadC2 功能驗(yàn)證
    5.1 材料
        5.1.1 菌株和質(zhì)粒
        5.1.2 酶，試劑及主要儀器
        5.1.3 培養(yǎng)基與抗生素
        5.1.4 引物
    5.2 方法
        5.2.1 代謝產(chǎn)物的檢測(cè)
        5.2.2 序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        5.2.3 鄰苯二酚含量的測(cè)定(p-aminophenol方法)
        5.2.4 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的測(cè)定
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 AD9 降解特性分析
        5.3.2 tadC1 和tadC2 基因的序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)比較
        5.3.3 原核表達(dá)載體pETC1 和pETC2 的構(gòu)建
        5.3.4 原核表達(dá)載體pETC1 和pETC2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析
        5.3.5 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶在大腸桿菌中的表達(dá)
        5.3.6 鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活測(cè)定
    5.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3819398