發(fā)布時(shí)間：2023-04-12 02:50

　　本研究從吉林化工廠污水排污口於泥、四平金士百啤酒廠污水排污口於泥、四平聯(lián)合化工有限公司污水排污口於泥和江蘇常州咔唑生產(chǎn)廠地表污染土四個(gè)樣品中分離到12株可以在咔唑?yàn)槲ㄒ惶荚春偷吹腃NFMM選擇固體平板上良好生長的革蘭氏陰性細(xì)菌株。通過16S rDNA基因序列比對分析，12個(gè)菌株分別屬于6個(gè)菌屬。JH061、PJ062、JS061和JS062四個(gè)菌株屬于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）；JH051、PJ051、PJ052和LH051屬于芽孢桿菌（Bacillus sp.）；JH052屬于金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）、JH062屬于黃色氫噬胞菌（Hydrogenophaga intermedia）、PJ053屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）和PJ061屬于Pandoraea sp.。 研究了節(jié)桿菌PJ053菌株的最適生長條件以及進(jìn)化關(guān)系。與大腸桿菌JM109相比生長速度稍慢，30℃和pH 7為PJ053菌株的最適培養(yǎng)條件。菌落較光滑，邊緣整齊，呈明亮的黃色，菌落形狀比較有規(guī)則，呈圓形，菌株呈短桿狀。進(jìn)化樹表明節(jié)桿菌PJ053與四個(gè)...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
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英文摘要
引言
    1. 芳香族化合物生物降解的研究現(xiàn)狀
    2. 細(xì)菌生物降解途徑的遺傳與進(jìn)化
    3. 咔唑降解途徑和聯(lián)苯雙加氧酶的研究
        3.1 咔唑降解途徑
        3.2 聯(lián)苯雙加氧酶基因簇的研究
        3.3 咔唑降解基因簇與聯(lián)苯降解基因簇的相關(guān)性
    4. 基因工程菌在芳香族化合物生物降解中的應(yīng)用
    5. 本研究工作的意義及目的
第一章、咔唑降解菌株的富集培養(yǎng)與菌種鑒定
    1. 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)方法
            1.3.1 咔唑降解菌株的富集培養(yǎng)
            1.3.2 細(xì)菌的革蘭氏染色
            1.3.3 165 rDNA 基因的克隆與鑒定
            1.3.4 插入片段的序列測定及分析
            1.3.5 PJ053 在不同pH條件下生長曲線的測定
    2. 結(jié)果
        2.1 樣品的富集培養(yǎng)與菌種的分離純化
        2.2 菌株的165 rDNA 分子生物學(xué)鑒定
        2.3 PJ053 菌株的特性分析
    3. 討論
第二章 PJ053 菌株中2 , 3 -二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(23DHBD) 基因和3, 4 -二羥苯乙酸-2 , 3 -雙加氧酶(HPCD) 基因的克隆、鑒定與菌株中基因簇的解析
    1. 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)方法
            1.3.1 基因組文庫的構(gòu)建
            1.3.2 2 , 3- 二羥基聯(lián)苯雙加氧酶(23DHBD) 基因和3 , 4 - 二羥苯乙酸- 2 ,3-雙加氧酶(HPCD) 基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.3.3 23DHBD 基因在PJ053 基因組DNA 上的定位
            1.3.4 23DHBD 和HPCD 蛋白表達(dá)及純化
            1.3.5 23DHBD 和HPCD 融合蛋白抗體的制備及抗體效價(jià)的檢測
            1.3.6 23DHBD 和HPCD 蛋白的 Western-blot 檢測
            1.3.7 不同菌株中23DHBD 酶活分析
    2. 結(jié)果
        2.1 PJ053 基因組文庫的構(gòu)建
            2.1.1 PJ053 基因組DNA 的不完全酶切條件的優(yōu)化
            2.1.2 PJ053 基因組DNA 片段與pUC19 的連接、轉(zhuǎn)化與篩選
            2.1.3 陽性克隆的酶切鑒定
            2.1.4 陽性克隆的序列測定
        2.2 兩株陽性克隆質(zhì)粒中插入片段的軟件分析
            2.2.1 pUCW402 中插入片段的 GenSCAN 軟件分析
            2.2.2 pUCW402 中插入片段的 BLAST 分析
            2.2.3 pUCW331 中插入片段的 GenSCAN 軟件分析
            2.2.4 pUCW331 中插入片段的 BLAST 分析
            2.2.5 23DHBD 基因的多態(tài)性分析
        2.3 23DHBD 基因和HP CD 基因的克隆及鑒定
            2.3.1 23DHBD 基因在 PJ053 基因組 DNA 上的定位
            2.3.2 23DHBD 基因和H PCD 基因的PCR 亞克隆
        2.4 23DHBD 基因和HP CD 基因在不同菌株中的表達(dá)
            2.4.1 23DHBD 基因和H PCD 基因的原核表達(dá)
            2.4.2 23DHBD 和 HPCD 的蛋白純化
            2.4.3 23DHBD 和HPCD 抗體的制備及 ELASE 檢測
            2.4.4 基因工程菌和PJ053中23DHBD 和HPCD 表達(dá)情況的Western 檢測
        2.5 不同菌株中23DHBD 酶活分析
            2.5.1 最適溫度和最適pH 的確定
            2.5.2 不同底物條件下酶活的測定
    3. 討論
        3.1 PJ053 基因組文庫構(gòu)建
        3.2 23DHBD 和HPCD 的解析
        3.3 基因工程菌株與野生菌株比較
        3.4 PJ053 菌株中芳香族化合物降解途徑解析
第三章 咔唑降解基因簇中carB 基因的克隆與表達(dá)
    1. 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)方法
            1.3.1 CarB 基因的克隆與鑒定
            1.3.2 BL21(pETW-JS1) 和BL21(pETW-JH2) 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
    2. 結(jié)果
        2.1 咔唑降解途徑中carB 基因的克隆及鑒定
        2.2 carB 基因序列的序列分析
        2.3 carB 基因的表達(dá)
    3. 討論
結(jié)論
    1 .對四個(gè)土壤樣品的菌種進(jìn)行富集培養(yǎng), 篩選到12株咔唑降解菌株
    2 .節(jié)桿菌 PJ053 形態(tài) 、生長條件及進(jìn)化分析結(jié)果
    3 .構(gòu)建了節(jié)桿菌PJ053基因組文庫并獲得兩株陽性克隆
    4 . 首次在節(jié)桿菌 PJ053中發(fā)現(xiàn)了23DHBD 基因
    5 .亞克隆23 DHBD和 HPCD基因并構(gòu)建了蛋白高效表達(dá)的基因工程菌
    6 .對23DHBD和HPCD進(jìn)行蛋白表達(dá) 、 純化并制備多克隆抗體 �；蚬こ叹昱c野生型菌株 PJ053表達(dá)23DHBD和HPCD蛋白的水平進(jìn)行了 Western Blotting檢 測
    7 .從JS061和JH062菌株中克隆了CarB基 因
參考文獻(xiàn)
附錄
致 謝
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本文編號：3790276